Результаты комбинированного и неинвазивного пренатального скрининга методом высокопроизводительного секвенирования при прогнозировании хромосомных анеуплоидий плода у женщин с привычным выкидышем

• Ким Людмила Викторовна
• Тетруашвили Нана Картлосовна
• Трофимов Дмитрий Юрьевич
• Барков Илья Юрьевич
• Шубина Екатерина Сергеевна
• Парсаданян Нанэ Геворковна
• Федорова Наталья Игоревна
• Гольцов Андрей Юрьевич

Резюме

Цель исследования - сравнить эффективность стандартного комбинированного скрининга I триместра беременности и неинвазивного пренатального ДНК-скрининга анеуплоидий плода по крови матери (НИПС) при прогнозировании хромосомных анеуплоидий (ХА) у женщин с привычным выкидышем (ПВ).

Материал и методы. Результаты стандартного комбинированного скрининга и результаты НИПС были получены для 600 беременных в сроках от 11 до 17 нед: 270 женщин наблюдались по поводу ПВ, а 330 про­ходили обследование по сумме других показаний.

Результаты. При исследовании ДНК плода в плазме беременной с использованием высокопроизводи­тельного секвенирования были правильно идентифицированы все случаи аутосомных трисомий (21-й, 18-й и 13-й) и верно определен пол плода во всех случаях. Среди всех результатов НИПС у 270 пациенток с ПВ ложноположительных результатов не было. В 269 из 270 случаев у женщин с ПВ получены точные резуль­таты ДНК-скрининга, в 1 случае получен ложноотрицательный результат, связанный с мозаичной формой синдрома Дауна, постнатально подтвержденной методом FISH.

Заключение. Исследование показало, что НИПС является точным методом для скрининга ХА плода с ранних сроков беременности, позволяет детектировать случаи ХА у женщин из группы низкого риска и может быть рекомендован женщинам в качестве высокоэффективного пренатального скрининга.

Ключевые слова:неинвазивный пренатальный ДНК-скрининг, анеуплоидии, неинвазивный пренатальный скрининг, свободная ДНК, беременность, скрининг, угрожающий выкидыш

Лидирующим фактором в этиологии самопроизволь­ного прерывания беременности до 22 нед выступа­ют хромосомные анеуплоидии (ХА), частота кото­рых при спорадических потерях достигает 82-88% [1].

Наиболее частые варианты ХА при ранних самопроиз­вольных выкидышах - аутосомные трисомии (52%), моносомии Х (19%), полиплоидии (22%). Другие формы отме­чают в 7% случаев. В 80% случаев вначале происходит гибель, а затем экспульсия плодного яйца [2].

При привычных выкидышах (ПВ), когда в анамнезе у супружеской пары отмечено 2 и более последователь­ные потери беременности, вклад ХА значимо ниже - око­ло 15%. Однако это не умаляет роль генетического фак­тора в этих случаях - ведение беременности у данной категории женщин требует тщательного обследования для выявления ХА [1, 2].

Факторы, вызывающие прерывание беременности, мож­но разделить на материнские и эмбриональные. Среди при­чин спорадических ранних выкидышей выделяют анатоми­ческие, эндокринные, инфекционные и иммунологические факторы - они в большей мере служат причинами ПВ при­мерно у 40-60% обследованных супружеских пар [3-5].

Акушеры-гинекологи основное внимание уделяют об­следованию супругов с привычным невынашиванием бе­ременности, однако следует учитывать, если эмбрион имеет аномалии, несовместимые с нормальным развитием, при любом состоянии родительского организма сохранять бе­ременность невозможно и нецелесообразно. Современные методы исследования (микроматричный анализ ДНК, анализ эпигенетического статуса импринтированных генов и т.п.) позволяют получить принципиально новую дополнитель­ную информацию о причинах ПВ [3]. Вспомогательные ре­продуктивные технологии: экстракорпоральное оплодотво­рение (ЭКО) и преимплантационный генетический скрининг (ПГС), - открывают новые возможности для преодоления этих нарушений с целью выполнения основной задачи ре­продуктивной медицины - рождения здоровых детей [5-8].

При ведении наступившей беременности у женщин с ПВ крайне актуально неинвазивное прогнозирование ХА. До недавнего времени единственной возможностью было проведение комбинированного скрининга, включа­ющего эхографию и определение содержания сывороточ­ных маркеров: PAPP-A и хорионического гонадотропина (β-ХГ), - с последующей компьютерной обработкой дан­ных (приказ Минздрава России № 572н от 12.11.2012).

С появлением метода высокопроизводительного секвенирования открылась перспектива проведения неинвазивного пренатального скринингового (НИПС) теста по периферической крови беременных женщин в сроках 11­17 нед. У женщин с ПВ, беременность которых часто проте­кает с осложнениями и на фоне приема гормональных пре­паратов, проведение теста, основанного на прямом анализе внеклеточной ДНК плацентарного происхождения, пред­ставляет большой научный и практический интерес [1, 3, 9].

Цель настоящего исследования - проанализировать результаты общепринятого скрининга I триместра бере­менности и НИПС методом высокопроизводительного секвенирования для прогнозирования ХА у женщин с ПВ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Были проанализированы результаты исследования 600 женщин в сроках беременности 11-17 нед. Соб­ран анамнез пациенток исследуемых групп - данные о возрасте, социально-экономическом положении, про­фессиональных вредностях, наследственности, проана­лизированы экстрагенитальная и гинекологическая заболеваемость, характер менструальной функции, ре­продуктивный анамнез. Из 600 женщин 270 наблюдались по поводу ПВ - у них в анамнезе было ≥2 последова­тельных самопроизвольных прерываний беременностей (они составили основную группу исследования), у 330 пациенток привычных гестационных потерь не отмечено (группа сравнения). Проведено клиническое обследо­вание, скрининг I триместра беременности: эхография, определение содержания сывороточных маркеров, ком­пьютерный анализ. Всем 600 женщинам после подпи­сания информированного согласия и разъяснения всех возможностей и ограничений метода проводили НИПС. У всех женщин было получено добровольное согласие на исследование и забор периферической крови из вены. При данном исследовании учитывали все ограниче­ния НИПС: онкологические заболевания у беременной женщины, многоплодная беременность, включая случаи спонтанной редукции одного из плодов, индекс массы тела пациентки >30 кг/м².

Результаты скрининга интерпретировал врач-генетик. Во всех случаях, когда требовалось менять тактику веде­ния беременности, пациенток направляли на инвазивную процедуру (амниоцентез) с последующим кариотипированием.

Методика проведения НИПС. Исследование прове­дено лабораторией молекулярно-генетических методов ФГБУ "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова" Минздрава России. Анализирова­ли образцы материнской венозной крови (10 мл ЭДТА) беременных женщин с одноплодной беременностью. Была предоставлена информация по каждому образцу крови, код пациентки выставляли автоматически, учиты­вали возраст женщины, гестационный срок, дату забора крови.

Полученный материал анализировали с помощью по­лупроводникового высокопроизводительного секвенирования. В периферической крови женщины определя­ли наличие или отсутствие ХА у плода, а также его пол. На первом этапе из крови матери отделяли плазму. На втором - выделяли внеклеточную ДНК, содержащую материнскую и фетальную фракции. В последующем по­следовательно осуществляли приготовление библиотек ДНК для высокопроизводительного секвенирования, эмульсионную полимеразную цепную реакцию и секвенирование на приборе IonProton (LifeTechnologies, США). Результаты оценивали с помощью биоинформатической обработки данных секвенирования ДНК. Для сравнения покрытия внутри образца применяли Γ-test.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В ходе проведенного исследования были проанали­зированы клинические и анамнестические данные 600 женщин, включенных в исследование на основании кри­териев, изложенных выше.

Средний возраст женщин в исследуемых группах со­ставил 33,9 года: в группе сравнения - 34,5±4,5 года, в основной группе - 33,1±4,6 года. Женщины исследуе­мых групп были сопоставимы по возрасту (табл. 1).

Из табл. 1 следует, что 43,0% женщин из основной группы и 52,7% женщин из группы сравнения относились к возрастной категории 35 лет и старше. В группе сравне­ния достоверно больше отмечено беременных в возрасте 45 лет и старше. Все женщины проживали в одинаковых климатогеографических условиях (преимущественно в Москве и в Московской области), имели среднее и выс­шее образование. Профессиональных вредностей при сборе анамнеза не выявлено.

При анализе частоты соматических заболеваний, представленных в табл. 2, достоверных различий между пациентками этих группы не отмечено.

Субклинический гипотиреоз, медикаментозно компен­сированный во время беременности, был обнаружен у 95 женщин из группы сравнения и у 81 женщины из основ­ной группы, будучи наиболее частой экстрагенитальной патологией. Вероятно, это связано с преобладанием в этой группе женщин старшего репродуктивного возрас­та, а также беременных с отягощенным акушерским анам­незом, часто сопряженным с сопутствующей патологией щитовидной железы.

При анализе частоты гинекологических заболеваний установлена более высокая частота обнаружения хро­нических воспалительных заболеваний органов малого таза у пациенток из основной группы (р=0,02), чаще всего в анамнезе отмечен эндометрит и/или сальпингит, оофорит, пролеченный до наступления данной беременности (табл. 3).

Оперативные вмешательства при эндометриозе, эндометриодных кистах яичников, внутриматочных синехиях и полипах проведены в 39 случаях у женщин из группы сравнения, в основной группе оперативные вмешатель­ства проведены в 73 случаях. Воспалительные заболева­ния органов малого таза, эктопия шейки матки и субсе­розная миома матки также чаще встречались у женщин из этой группы.

При анализе менструальной функции и продолжи­тельности менструального цикла достоверных различий между беременными основной группы и группы сравне­ния не отмечено.

Была проанализирована репродуктивная функция всех женщин. Выявлено, что у всех беременных из основ­ной группы в анамнезе было 836 беременностей. Наи­более часто у женщин из этой группы в анамнезе отме­чались ранние гестационные потери: самопроизвольные выкидыши или неразвивающиеся беременности - 50,4% от числа всех наступивших беременностей (табл. 4).

У 11,2% женщин в анамнезе отмечались поздние вы­кидыши, причиной которых был хориоамнионит или излитие околоплодных вод.

При анализе исходов беременностей у женщин из основной группы установлены самопроизвольные потери беременности до 22 нед в 61,6% случаев, из них в 37 (7,2%) случаях с плохим кариотипом, преждевременные роды (до 37 нед) в 21,3% наблюдений.

Исходя из анамнестических данных беременные с ПВ составляют группу риска по реализации ранних и поздних гестационных осложнений, а это диктует необходимость выбора правильной терапевтической тактики: свое­временного прогнозирования ХА плода скрининговыми тестами и определения показаний для проведения инвазивных процедур с случаях крайне высокого риска.

Наблюдение и родоразрешение большинства паци­енток исследуемых групп проходили на базе ФГБУ "На­циональный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова" Минздрава России, где был проведен анализ течения беременностей с сопоставлением ча­стоты гестационных осложнений.

В 90 случаях у женщин из основной группы беремен­ность осложнилась угрожающим/начавшимся выкиды­шем (боли в низу живота и пояснице), подтвержденными клиническими признаками и данными ультразвукового исследования.

При кровянистых выделениях из половых путей про­водили эхографию, в результате которой была выявлена ретрохориальная гематома в 29 (10,7%) случаев, ретроамниотическая гематома в 31 (11,5%) случаев. У остальных 5 (1,9%) женщин жалоб во время I триместра беремен­ности не отмечалось.

У пациенток из группы сравнения в I триместре бе­ременности регистрировали следующие осложнения: острая респираторно-вирусная инфекция с субфебрильной температурой тела - 5,5%, умеренная рвота - 14,6%, анемия - 6,4%. Явления угрожающего/начавшегося вы­кидыша в виде болей в низу живота и в пояснице, скудных кровянистых выделений отмечены в 108 (32,7%) случаях.

Осложнения беременности I триместра у женщин обеих групп представлены в табл. 5.

Во всех случаях угрожающего/начавшегося выкидыша пациенток госпитализировали в акушерское отделение пато­логии беременности, где им проводили терапию, направлен­ную на пролонгирование беременности, включающую гор­мональные, гемостатические и спазмолитические препараты.

Несмотря на проводимую терапию прерывания бере­менности отмечены у 6 женщин основной группы при нор­мальном кариотипе плода, из них у 5 женщин до 22 нед, у 4 женщин имел место поздний самопроизвольный выки­дыш (излитие околоплодных вод, неразвивающаяся бере­менность) в 12-19 нед, у 1 пациентки в 19 нед беремен­ность была прервана по медицинским показаниям (порок развития плода, несовместимый с жизнью, - омфалоцеле), у 1 женщины отмечена антенатальная гибель плода в 32 нед. В группе сравнения прерывания беременности отмечены у 4 женщин до 22 нед, причем у 3 женщин - ан­тенатальная гибель плода, в 1 случае с ХА (трисомия 21), в 1 случае в сроке 18 нед прерывание беременности по медицинским показаниям (множественные пороки раз­вития центральной нервной системой).

В 19 наблюдениях по результатам НИПС получен вы­сокий риск ХА, беременным рекомендовано проведение инвазивной пренатальной диагностики (табл. 6).

Из данных, представленных в табл. 6, следует, что у 53 женщин по данным комбинированного скрининга I триместра был диагностирован высокий риск по ре­зультатам программы Astraya. Доля женщин с высоким риском достоверно не различалась с аналогичным пока­зателем в основной группе (8,8%) и в группе сравнения (8,7%) (р=0,96). При этом лишь у 5 (9,4%) женщин из 53 по результатам НИПС был подтвержден высокий риск ХА. В то же время у 3 женщин (2 из основной группы и 1 из группы сравнения), относящихся к группе низкого риска по данным общепринятого скрининга, по данным НИПС был выявлен высокий риск, что в последующем было под­тверждено инвазивной диагностикой.

Отмечено, что у женщин из основной группы достовер­но чаще уровень β-ХГ отличался от нормативных значений, что, вероятно, связано с особенностями плацентации у бе­ременных с неоднократными потерями беременности.

ОБСУЖДЕНИЕ

Реализация репродуктивной функции в старшем ре­продуктивном возрасте и увеличение неблагоприятных исходов беременностей при предшествующих неудачах диктуют необходимость точного подхода к проведению диагностических процедур, особенно инвазивных [10-15].

Часто обсуждаются генетические причины ПВ. Извест­но, что ХА являются наиболее частыми генетическими на­рушениями, встречающимися и при спорадических, и при привычных выкидышах.

В настоящее время существует общепринятый прото­кол комбинированного скрининга беременных, включаю­щий эхографию и определение биохимических маркеров. Из проведенного исследования следует, что женщины с ПВ отличаются достоверно более высоким уровнем по­казателей β-ХГ, при этом по результатам НИПС высокий риск не подтвержден. В то же время у 3 женщин с выяв­ленной ХА (из них 2 женщины из основной группы) по данным комбинированного скрининга был диагностиро­ван низкий риск.

При ведении беременности у женщин с ПВ, протекаю­щей с выраженной угрозой прерывания в первой поло­вине беременности, встает вопрос о целесообразности проведения сохраняющей терапии. ХА остаются одной из наиболее частых причин потери беременности на ранних сроках, а отсутствие данных о кариотипе развивающегося эмбриона/плода осложняет выбор правильной акушер­ской тактики [23, 24].

Внедрение НИПС методом высокопроизводительно­го секвенирования - безопасного метода для женщины и плода открывает новые возможности ведения беремен­ности у женщин с ПВ и акушерской патологией [25-28].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У женщин с отягощенным акушерским анамнезом, а также с угрожающим или начавшимся выкидышем НИПС ХА методом высокопроизводительного секвенирования является методом выбора при прогнозировании ХА пло­да, позволяющим избежать осложнений, обусловленных инвазивными диагностическими процедурами, и оптими­зировать дальнейшую тактику ведения беременности.

Работа поддержана Министерством образования и науки Российской Федерации (соглашение № 14.607.21.0136, идентификатор проекта RFMEFI60715X0136).

ЛИТЕРАТУРА

1. Айламазян Э.К., Мозговая Е.В. Гестоз: теория и практи­ка. М. : Медпресс-информ, 2008.

2. Benn P., Cuckle H., Pergament E. Non-invasive prenatal testing for aneuploidy: current status and future prospects // Ultrasound Obstet. Gynecol. 2013. Vol. 42, N 1. P. 15-33. doi: 10.1002/uog.12513.

3. Саженцева Е.А., Никитина Т.В. Эпигенетический статус импринтированных генов в плаценте при привычном невынашивании беременности // Генетика. 2017. Т. 53, № 3. С. 364-377.

4. Сухих Г.Т., Каретникова Н.А., Баранова Е.Е., Шубина Е.С. и др. Неинвазивная пренатальная диагностика анеуплоидий методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) в группе женщин высокого риска // Акуш. и гин. 2015. Т. 15, № 4. С. 5-9.

5. Rai R., Regan L. Recurrent miscarried // Lancet. 2006. Vol. 368. P. 601-611.

6. Stirrat G.M. Recurrent miscarried // Lancet. 2013. Vol. 336. P. 673-675.

7. Bianchi D.W., Wilkins-Haug L. Integration of noninvasive DNA testing for aneuploidy into prenatal care: what has happened since the rubber met the road? // Clin. Chem. 2014. Vol. 60, N 1. P. 78-87.

8. Бахарев В.А., Каретникова Н.А., Стыгар А.М. Неинвазивный скрининг беременных // Акуш. и гин. 2012. № 4. С. 26-31.

9. Благодатских Е.Г. Использование циркулирующих ДНК и мРНК для неинвазивного пренатального определения пола, резус фактора и диагностики синдрома Дауна у плода : автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2010. 23 с.

10. Малышева О.В., Баранов В.С. Неинвазивная пренатальная диагностика. Проблемы, подходы и перспективы // Журн. акуш. и женских бол. 2012. Т. LXI, № 3. С. 83-93.

11. Радзинский В.Е., Костин И.Н. Преждевременные роды // Акуш. и гин. 2009. № 4. С. 16-19.

12. Курцер М.А., Гнетецкая В.А. Диагностика хромосомных анеуплоидий с помощью неинвазивного пренатального теста // Акуш. и гин. 2015. Т. 15, № 8. С. 65-68.

13. Morain S., Greene M.F., Mello M.M. A new era in noninvasive prenatal testing // N. Engl. J. Med. 2013. Vol. 369, N 6. P. 499-501.

14. Neyt M., Hulsstaert F., Gyselaers W. Introducing the non-invasive prenatal test for trisomy 21 in Belgium: a cost-consequences analysis // BMJ Open. 2014. Vol. 11. C. 5-15.

15. Никитина Т.В., Лебедев И.Н. Цитогенетика привычного невынашивание беременности // Генетика.2014. Т. 50, № 5. С. 501-514.

16. Van Lith J.M.M., Faas B.H.W., Bianchi D.W. Current controversies in prenatal diagnosis 1: NIPT for chromosome abnormalities should be offered to women with low a prioririsk // Prenat. Diagn. 2015. Vol. 35. P. 8-14.

17. Neyt M., Hulsstaert F., Gyselaers W. Introducing the non-invasive prenatal test for trisomy 21 in Belgium: a cost-consequences analysis // BMJ Open. 2014. Vol. 11. P. 5-15.

18. Song Y., Liu C., Qi H. et al. Noninvasive prenatal testing of fetal aneuploidies by massively parallel sequencing in a prospective Chinese population // Prenat. Diagn. 2013. Vol. 33, N 7. P. 700-706.

19. Bianchi D.W., Parker R.L., Wentworth R. et al. DNA sequencing versus standard prenatal aneuploidy screening // N. Engl. J. Med. 2014. Vol. 27. P. 9-27.

20. Bianchi D.W., Wilkins-Haug L. et al. Integration of noninvasive DNA testing for aneuploidy into prenatal care: what has happened since the rubber met the road? // Clin. Chem. 2014. Vol. 60. P. 78-87.

21. Lim J.H., Kim M.H., Han Y.J. et al. Cell-free fetal DNA and cell-free total DNA levels in spontaneous abortion with fetal chromosomal aneuploidy // PLoS One. 2013. Vol. 8, N 2. Article ID e56787.

22. Barrett A.N., Chitty L.S. et al. Developing noninvasive diagnosis for single-gene disorders: the role of digital PCR // Methods Mol. Biol. 2014. Vol. 1160. P. 215-228.

23. Fairbrother G., Johnson S., Musci T.J., Song K. et al. Clinical experience of noninvasive prenatal testing with cell-free DNA for fetal trisomies 21, 18, and 13, in a general screening population // Prenat. Diagn. 2013. Vol. 33. P. 580-583.

24. Porreco R., Garite T., Maurel K. et.al. Noninvasive prenatal screening for fetal trisomies 21, 18, 13 and the common sex chromosome aneuploidies from maternal blood using massively parallel genomic sequencing of DNA // Am. J. Obstet. Gynecol. 2014 Mar. pii: S0002-9378(14)00270-1.

25. Papageorgiou E.A., Patsalis P.C. et al. Non-invasive prenatal diagnosis of aneuploidies: new technologies and clinical applications // Genome Med. 2012. Vol. 4. P. 46.

26. Benn P., Cuckle H., Pergament E. et al. Non-invasive prenatal testing for aneuploidy: current status and future prospects // Ultrasound Obstet. Gynecol. 2013. Vol. 42, N 1. P. 15-33.

27. Song Y., Liu C., Qi H., Zhang Y. et al. Noninvasive prenatal testing of fetal aneuploidies by massively parallel sequencing in a prospective Chinese population // Prenat. Diagn. 2016 Vol. 33. P. 700-706.

28. Morain S., Greene M.F., Mello M.M. et al. A new era in noninvasive prenatal testing // N. Engl. J. Med. 2015. Vol. 369. P. 499-501.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)