Изменение липидома эутопического эндометрия женщин с эндометриозом и миомой матки при различных фазах менструального цикла

Резюме

Актуальность. Эндометриоз и миома матки остаются основными причинами бесплодия у женщин репродуктивного возраста. Данные гиперпролиферативные и гормонозависимые гинекологические заболевания часто сопровождаются хронической тазовой болью, снижающей качество жизни женщин. Выяснение основных патогенетических механизмов, а также их влияние на эутопический эндометрий важно для определения этиологии заболевания и разработки методов его диагностики, лечения и прогнозирования рецидива или развития.

Цель данной работы - выяснить влияние гиперпролиферативных заболеваний, а также фазы менструального цикла на молекулярный профиль эндометрия путем сравнения липидного состава эутопического эндометрия у 40 женщин с эндометриозом и миомой матки в разных фазах менструального цикла.

Материал и методы. Полуколичественную оценку липидов в экстрактах тканей проводили с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС). В результате анализа было идентифицировано 247 липидов, относящихся к 6 классам: фосфатидилхолины, фосфати-дилэтаноламины, сфингомиелины, триглицериды, плазмалогены и эфиры холестерина. Данные были проанализированы с помощью дискриминантного анализа методом OPLS-DA. Статистические модели OPLS-DA для миомы (R2=63% и Q2=47%) и эндометриоза (R2=80% и Q2=75%) выявили отличия липидных профилей эутопического эндометрия в пролиферативной и секреторной фазах менструального цикла.

Результаты. При эндометриозе обнаружено значимое отличие уровней 16 липидов между пролиферативной и секреторной фазами менструального цикла, а при миоме матки - 13 липидов. Эти липиды непосредственно участвуют в общих процессах исследуемых гиперпролиферативных нарушений, включая пролиферацию клеток, ангиогенез, изменения в иммунном ответе.

Заключение. Полученная информация расширяет знания о влиянии эндометриоза и миомы на организм человека на молекулярном уровне, а также свидетельствует о необходимости учета фазы менструального цикла в подобных исследованиях.

Ключевые слова:масс-спектрометрия, липидомика, эндометриоз, миома, менструальный цикл, патогенез, эпителий

Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 19-515-55021.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Для цитирования: Салимова Д.Ф., Стародубцева Н.Л., Чаговец В.В., Токарева А.О., Тоноян Н.М., Павлович С.В., Франкевич В.Е. Изменение липидома эутопического эндометрия женщин с эндометриозом и миомой матки при различных фазах менструального цикла // Акушерство и гинекология: новости, мнения, обучение. 2020. Т. 8, № 1. С. 8-15. doi: 10.24411/2303-9698-2020-11001

Эндометриоз - это доброкачественное гинекологическое заболевание, характеризующееся наличием ткани эндометрия за пределами полости матки [1]. Это чрезвычайно распространенное заболевание, встречающееся у 10% женщин репродуктивного возраста. Боль является самым частым (71-87% случаев) и специфическим симптомом эндометриоза. Эндометриоз приводит к бесплодию почти у 50% женщин [2]. Таким образом, эндометриоз является важной клинической и социальной проблемой. Ранняя диагностика и эффективное лечение имеют первостепенное значение. "Золотой стандарт" диагностики эндометриоза - лапароскопия с гистологической верификацией. Однако в среднем проходит около 12 лет от появления клинических симптомов до подтверждения диагноза и назначения соответствующего лечения [3]. Патофизиология эндометриоза до настоящего времени до конца не изучена. Предполагается, что появление эктопического эндометрия связано с дисбалансом между пролиферацией и апоптозом, хроническим воспалением, окислительным стрессом, усилением ангиогенеза, нарушением регуляции половых гормонов и факторов роста [4].

Миома матки (лейомиома, миома) - наиболее распространенная доброкачественная гинекологическая опухоль, поражающая до 77% женщин предменопаузального возраста. Миома определяется как гормонозависимая моноклональная опухоль, возникающая из гладкомышечных клеток миометрия [5]. В 20-30% случаев при лейомиоме проявляются такие симптомы, как боли в области таза, дис-меноря, меноррагия, нарушения репродуктивной функции и дисфункции органов малого таза. Наиболее информативными методами диагностики миомы являются УЗИ, магнитно-резонансная томография, соногистерография и гистероскопия [6].

Ранние исследования показали, что эндометриоз и лейомиома имеют очень сходные патофизиологические механизмы [7]. Обе патологии представлены повышенной пролиферацией клеток, сниженным апоптозом, дисбалансом половых стероидных гормонов. Также были обнаружены эпигенетические изменения: гиперметилирование и повышенная экспрессия скорости оседания эритроцитов (СОЭ) (рецептор эстрогена), WNT4, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), колониестимулирующего фактора грануло-цитов-макрофагов (GM-CSF), рецептора фактора роста фибробластов (FGFR) и др. [8]. Активация путей MAPK/ERK, PI3K/Akt, снижение экспрессии PR (рецептора прогестерона), ER (рецептора эстрогена), HOXA-10, интегрина aVp3 и активация NF-kB, BcL-2 в эндометрии приводят к подавлению апоптоза и увеличению пролиферации. Мезенхимальные стромальные клетки - предшественники эндометриоидных и лейомиомных клеток также обладают некоторым морфологическим и функциональным сходством [8].

Липиды являются биологически активными соединениями, регулирующими ряд клеточных процессов: пролиферацию и апоптоз, клеточную инвазию и ангиогенез [9]. Например, фосфатидилхолины, сфингомиелины и фосфати-дилинозитолы способствуют развитию различных гинекологических заболеваний: эндометриоз [10], рак яичника [11] и рак молочной железы [12]. Высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС) - наиболее информативный метод анализа липидов [13].

Эндометрий - это гормонозависимая ткань, меняющаяся в течение менструального цикла [14]. F. ViLeLLa и соавт. обнаружили значительные различия в экспрессии простагландинов в разных фазах менструального цикла [15]. Однако данные о липидном составе эндометрия во время менструального цикла с миомой и эндометриозом отсутствуют.

Цель данного исследования - сравнить липидный состав эутопического эндометрия женщин с эндометриозом и миомой матки в разные фазы менструального цикла методом ВЭЖХ-МС.

Материал и методы

Образцы тканей были получены от 20 пациенток с наружным генитальным эндометриозом и от 20 пациенток с миомой матки, которым была проведена лапароскопическая операция в отделении гинекологической хирургии ФГБУ "НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова". Демографические и клинические характеристики пациентов представлены в таблице. Все пациентки, включенные в исследование, дали письменное информированное согласие. Комиссия по биомедицинской этике при ФГБУ "НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова" одобрила все процедуры и методы исследования.

Критерии включения: репродуктивный возраст (1945 лет) и регулярный менструальный цикл (продолжительность цикла варьировала от 25 до 35 дней).

Критерии исключения: ненормальное маточное кровотечение, гормональное лечение в течение 6 мес до операции, воспалительные заболевания таза, патология эндометрия (гиперплазия и рак эндометрия, внутриматочные спайки), подозрение на наличие аденомиоза по данным ультразвукового исследования и тяжелой соматической патологии, злокачественные новообразования.

Диагноз эндометриоз был подтвержден во время лапароскопии и гистологически. Стадию эндометриоза определяли в соответствии с системой классификации Американского общества репродуктивной медицины. Локализация, количество и размер миомы матки у пациентов с лейомиомой также были выявлены при лапароскопии. Фаза менструального цикла определялась по гистологическим критериям Noyes и др. [14].

Эутопические ткани эндометрия (~50 мг) были получены во время операции после раздельного диагностического выскабливания эндометрия и промыты в физиологическом растворе, охлажденном до 4 °С. Собранные образцы помещали в пластиковую пробирку, замораживали в жидком азоте и хранили при -80 °С до анализа.

Экстракты липидов готовили по модифицированному методу Фолча: 50 мг ткани гомогенизировали в жидком азоте, добавляли в гомогенат 5 мкл внутреннего стандарта и 1400 мкл смеси хлороформ/метанол (2:1) и инкубировали в ультразвуковой бане в течение 10 мин. Разделение на фазы инициировали добавлением 440 мкл водного раствора NaCL (1 моль/л). После перемешивания с помощью Vortex в течение 10 с смесь центрифугировали при 13 000g в течение 5 мин при комнатной температуре. Нижний органический слой, содержащий липиды, собирали и к оставшейся смеси добавляли 730 мкл раствора хлороформ/метанол (2:1); смесь центрифугировали при тех же условиях. Органический слой вновь собирали и объединяли с органическим слоем, отобранным на предыдущем этапе. Полученный раствор сушили в потоке азота при комнатной температуре. После высушивания образец растворяли в 500 мкл раствора изопропанол/ацетонитрил (1:1) для анализа на ВЭЖХ-МС.

ВЭЖХ-МС анализ проводили на жидкостном хроматографе Dionex Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific, Германия) в сочетании с масс-спектрометром Maxis Impact qTOF (Bruker Daltonics, Германия) при следующих условиях: колонка AgiLent Zorbax SB-C18 (150x0,5 мм, 5 мкм); скорость потока 35 мкл/мин, температура колонки 50 °С. Все образцы были проанализированы при следующих параметрах: режим положительных ионов, напряжение на капилляре 4,5 кВ, давление распыляющего газа 0,6 бар, скорость потока осушающего газа 5 л/мин при температуре 200 °С и диапазон масс m/z 100-1700. Каждый образец анализировали 3 раза. Анализ с использованием тандемной масс-спектрометрии проводили при энергии соударения равной 35 эВ и ширине окна изоляции ионов 5 Да.

Полученные в результате масс-спектрометрического анализа файлы данных преобразованы в формат MzXml с использованием программы MSConvert. Деконволюция хроматограммы, извлечение пиков и построение таблицы, содержащей площадь пика, его время удерживания и m/z выполнены в программе MzMine. Идентификация липидов сделана с помощью программы LipidMatch по таблице, полученной в MzMine. Липиды исключались из рассмотрения, если стандартное отклонение площади соответствующего пика по группе (диагноз и стадия цикла) превышало среднее значение площади по группе.

Приведенную таблицу с полуколичественными данными содержания липидов в образцах использовали для статистического анализа. Данные нормировали по методу Парето и затем сравнивали липидный состав образцов разных групп с помощью дискриминантного анализа методом ортогональной проекции на скрытые структуры (OPLS-DA) в пакете R [16]. Этот метод строит статистическую модель на обучающей выборке с известными диагнозами. Новые образцы классифицируют с использованием созданной модели. Качество статистической модели оценивается параметрами R2 и Q2, где R2 описывает долю данных, которую модель может объяснить скрытыми переменными, а Q2 - часть данных, прогнозируемых моделью в соответствии со случайной перекрестной проверкой.

Подход OPLS-DA позволяет не только классифицировать образцы, но и выявлять ионы (m/z) в масс-спектрах, ответственные за различия в группах (с наибольшими значениями VIP согласно модели). Статистическая значимость ионов (m/z), предложенных в качестве потенциальных биомаркеров моделью OPLS-DA, была подтверждена непараметрическим тестом Манна-Уитни (р<0,05).

Результаты

В масс-спектрах, полученных в режиме положительных и отрицательных ионов эутопических тканей эндометрия, наиболее интенсивные пики соответствовали фосфатидилхолинам. Выявлено 247 пиков липидов, принадлежащих 6 различным классам: фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины, сфингомиелины, триглицериды, плазмалогены и эфиры холестерина.

MC-данные были проанализированы методом OPLS-DA для поиска липидов со значимо различающимся уровнем в разных фазах менструального цикла для образцов эндометрия от пациенток с эндометриозом (группа "эндометриоз") (рис. 1A) и миомой (группа "миома") (рис. 1Б). Статистическая модель OPLS-DA для группы "миома" (R2=63% и Q2=47%) показала хорошую способность для классификации неизвестных образцов эутопического эндометрия между пролиферативной (красные точки) и секреторной (синие точки) фазами менструального цикла. Еще лучшая точность была получена для эутопического эндометрия у пациентов с эндометриозом (R2=80% и Q2=75%).

Уровни липидов в эутопическом эндометрии со значимыми отличиями между пролиферативной и секреторной фазами менструального цикла у пациентов с миомой представлены на рис. 2А. Приведенные липиды характеризуются тем, что для них по результатам OPLS-DA анализа параметр VIP >1 и согласно тесту Манна-Уитни р<0,05.Эти липиды относятся к 4 классам: фосфатидил-холины PC (16:0_16:0, 16:0_16:1, 18:0_18:1, 18:0_20:4, 18:0_22:4), фосфатидилхолины плазмалогены (O-16:0/16:0, O-18:0/16:1), фосфатидилэтаноламины (16:0/18:0), триглицериды TG (16:0_18:1_18:2, 16:1_18:0_18:1, 18:0_18:1_18:2, 18:1_18:1_18:2, 18:1_18:2_20:2). При сравнении уровней липидов в эутопическом эндометрии пациентов с миомой значимые отличия между фазами менструального цикла были выявлены у фосфатидилхолинов (16:0_16:0, 16:0_16:1, 16:0_18:0, 16:0_18:2, 16:0_20:3, 16:1_18:0, 18:0_18:2, 18:0_20:3, 18:0_20:4), плазмалогенов фосфатидилхолинов (O-16:1/20:4, P-16:0/20:4, P-18:1/16:0, O-18:0/16:1), плаз-малогенов фосфатидилэтаноламинов (P-16:0/20:4), триглицеридов (14:1_16:1_18:2) и эфиров холестерина (20:3). Более 80% идентифицированных липидов включали полиненасыщенные жирные кислоты.

Обсуждение

Липиды представляют собой широкую группу метаболитов, включенных в клеточные структуры. Как ключевой компонент клеточных сигнальных путей и накопления энергии они играют важную роль в различных биологических процессах, таких как пролиферация, воспаление, ангиогенез и другие. И хотя эндометриоз и лейомиома - это разные заболевания, у них много общего. Сравнение особенностей липидного состава эндометрия при этих гиперпролиферативных патологиях может пролить некоторый свет на патогенез и предложить новые диагностические маркеры. В данном исследовании эутопический эндометрий у пациентов с эндометриозом и миомой матки был охарактеризован на разных фазах менструального цикла. Показано, что уровни фосфатидилхолинов, фосфатидилэтаноламинов, сфингомиелинов, триглицеридов, плазмалогенов и холестерина значительно изменяются в течение менструального цикла.

Одним из наиболее важных факторов, лежащих в основе развития эндометриоза и лейомиомы, является дисбаланс между пролиферацией и апоптозом в клетках эндометрия.

Считается, что активация пролиферации и подавление апоптоза - это результатом аберрантной эндокринной передачи сигналов, генетической нестабильности, нарушения иммунитета, нарушения факторов роста. Эти процессы тесно переплетены и не существуют отдельно. Нарушение одного звена порождает изменения во всех других, но основной триггер до сих пор не ясен. Предполагается, что некоторые липиды (в частности, сфингомиелины, фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины, плазмалогены, сложные эфиры холестерина) непосредственно участвуют в регуляции клетки.

Фосфатидилхолины (PC) - наиболее распространенные фосфолипиды в эукариотических мембранах. Один из наиболее важных биохимических путей, ведущих к синтезу фосфатидилхолина, известен как путь цитидиндифосфата. Клетки, проходящие из фазы G0 в фазу G1, характеризуются активацией пути цитидиндифосфатхолина и холина, повышающего синтез фосфатидилхолина. Продукты гидролиза фосфатидилхолина (фосфохолин и диацилглицерол) могут быть использованы митогенными путями, такими как ras-raf-MAPK и протеинкиназа С [17]. Наше исследование выявило повышенный уровень ряда PC (в частности, 16:0_16:0, 16:0_16:1, 18:0_18:1, 18:0_20:4, 18:0_22:4) в пролиферативном эндометрии группы с миомой. Однако в пролиферативном эндометрии у пациентов с эндометриозом было обнаружено существенное снижение некоторых РС (16:0_18:2, 16:0_20:3, 18:0_18:2, 18:0_20:3). Известно, что PC могут использоваться в пути сфингозинсинтазы и служить субстратом для синтеза сфингомиелина, а эндометриоз связан с повышенной активностью сфингозинсинтазы [10].

Сфингомиелины (SM) участвуют в различных сигнальных путях, включая регуляцию клеточного цикла. Некоторые метаболиты SM, такие как церамид и сфингозин, способствуют апоптозу, в то время как их производные церамид-1-фосфат и сфингозин-1-фосфат вызывают пролиферацию и выживание клеток в ответ на апоптотические стимулы [11]. В пролиферативном эндометрии обнаружен повышенный уровень SM 18:1/24:0 в случаях миомы матки по сравнению с эндометриозом. Окислительный стресс, отличительный признак эндометриоза, приводит к ускорению катаболизма SM. Ряд исследований выявили увеличение экспрессии гена SMPD-3, кодирующего фермент сфингомиелиназу [9, 10], и увеличение экспрессии некоторых других генов, способствующих синтезу C1P и S1P (ENPP7, ACERI, SPHKI) во время эндометриоза [18]. Таким образом, снижение синтеза SM в эутопическом эндометрии у пациентов с эндометриозом может отражать интенсивное использование этих липидов в процессах окисления и других путях. Аналогичный вывод сделали K. Vouk с соавт. [10]. Эндометриоз и лейомиома возникают и развиваются в результате локальной инвазии, ангиогенеза и нарушения иммунитета.

Плазмалогены (PL) обеспечивают текучесть мембран, передают внутриклеточные сигналы взаимодействием G-белков, участвуют в миграции клеток, митозе и фагоцитозе. PL обнаружены в различных тканях человека, но в основном в нервных, сердечно-сосудистых и иммунных [19]. Выявлена значимая разница уровней плазмогенов на разных фазах менструального цикла для групп эндометриоза и лейомиомы. В группе с эндометриозом наблюдались повышенные уровни плазмогенов как в пролиферативной (плазманилхолины O_16:1/20:4, O_18:0/16:1), так и в секреторной фазах (плазменилхолины P_18:1/16:0, плазменилэтаноламины P_16:0/20:4) менструального цикла. В пролиферативном эндометрии при миоме наблюдался повышенные уровни PC О_16:0/16:0, О_18:0/16:1. Ранее было обнаружено, что увеличение плазмогенов в ткани активирует макрофаги и последующий фагоцитоз [20].

Заключение

Липиды представляют собой биоактивные соединения, модулирующие ряд клеточных процессов: пролиферацию, апоптоз, клеточную инвазию и ангиогенез. Установлено, что фосфатидилхолины, сфингомиелины и фосфотидилинозитолы участвуют в развитии гиперпролиферативных гинекологических нарушений (эндометриоз, яичники, шейка матки и рак молочной железы). Эндометрий претерпевает значительные изменения во время менструального цикла, поскольку он является гормонозависимой тканью. В данной работе был изучен характер этих изменений в липидном составе эутопического эндометрия. Было обнаружено, что уровни некоторых фосфатидилхолинов, фосфатидилэтано-ламинов, сфингомиелинов, триглицеридов, плазмалогенов и эфиров холестерина в эутопическом эндометрии значительно отличаются во время менструального цикла при эндометриозе и миоме. Эти липиды участвуют в гиперпролиферативных процессах, включая измененную пролиферацию клеток, ангиогенез и изменения в иммунном ответе. Полученная информация расширяет знания о влиянии эндометриоза и миомы на организм человека на молекулярном уровне, а также свидетельствует о необходимости учета фазы менструального цикла в подобных исследованиях.

Литература/References

1. Koninckx P.R., Ussia A., Keckstein J.,Adamyan L.V., Zupi E.,Wattiez A., Gomel V. Evidence-Based Medicine: Pandora's Box of Medical and Surgical Treatment of Endometriosis. J Minim Invasive Gynecol. 2018; 25: 360-5.

2. Ozawa Y., Murakami T., Terada Y.,Yaegashi N., Okamura K., Kuriyama S., et al. Management of the pain associated with endometriosis. Tohoku J Exp Med. 2006; 210: 175-88.

3. Li J., Gao Y., Guan L., Zhang H., Sun J., Gong X., et al. Discovery of phosphatidic acid, phosphatidylcholine, and phosphatidylserine as biomarkers for early diagnosis of endometriosis. Front Physiol. 2018; 9: 1-7.

4. Clemenza S., Sorbi F., Noci I., Capezzuoli, T., Turrini, I., Carriero, C.et al. From pathogenesis to clinical practice: Emerging medical treatments for endometriosis. Best Pract. Res Clin Obstet Gynaecol. 2018; 51: 92-101.

5. Prusinski Fernung L.E., Jones K., Mas A., Kleven D., Waller J.L., Al-Hendy A. Expanding upon the Human Myometrial Stem Cell Hypothesis and the Role of Race, Hormones, Age, and Parity in a Profibroid Environment. Am J Pathol. 2018; 188: 2293-2306.

6. Lewis T.D., Malik M., Britten J., San Pablo A.M.A., Catherino W.H. A Comprehensive Review of the Pharmacologic Management of Uterine Leiomyoma. Biomed Res Int. 2018; 2018: 2414609.

7. Patel B.G., Lenk E.E., Lebovic D.I., Shu Y., Yu J., Taylor R.N. Pathogenesis of endometriosis: Interaction between Endocrine and inflammatory pathways. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2018; 50: 50-60.

8. Baranov V.S., Ivaschenko T.E., Yarmolinskaya M.I. Comparative systems genetics view of endometriosis and uterine leiomyoma: Two sides of the same coin? Syst Biol Reprod Med. 2016; 62: 93-105.

9. Lee Y.H., Tan C.W., Venkatratnam A., Tan C.S., Cui L., Loh S.F., et al. Dysregulated sphingolipid metabolism in endometriosis. J Clin Endocrinol Metab. 2014; 99: E1913-21.

10. Vouk K., Ribic-Pucelj M., Adamski J., Rizner T.L. Altered levels of acylcarnitines, phosphatidylcholines, and sphingomyelins in peritoneal fluid from ovarian endometriosis patients. J Steroid Biochem Mol Biol. 2016; 159: 60-9.

11. Doria M.L., McKenzie J.S., Mroz A., Phelps D.L., Speller A., Rosini F. et al. Epithelial ovarian carcinoma diagnosis by desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Sci Rep. 2016; 6: 1-11.

12. Ctfkova E., Holcapek M., Ltsa M., Vrana D., Gatek J., Melichar B. Determination of lipidomic differences between human breast cancer and surrounding normal tissues using HILIC-HPLC/ESI-MS and multivariate data analysis. Anal Bioanal Chem. 2015; 407: 991-1002.

13. Han X. Lipidomics for studying metabolism. Nat Rev Endocrinol. 2016; 12: 668-79.

14. Noyes R.W., Hertig A.T., Rock J. Dating the endometrial biopsy. Obstet Gynecol Surv. 1950; 5: 561-4.

15. Vilella F., Ramirez L.B., Simon C. Lipidomics as an emerging tool to predict endometrial receptivity. Fertil Steril. 2013; 99: 1100-6.

16. Thevenot E.A., Roux A., Xu Y., Ezan E., Junot C. Analysis of the Human Adult Urinary Metabolome Variations with Age, Body Mass Index, and Gender by Implementing a Comprehensive Workflow for Univariate and OPLS Statistical Analyses. J Proteome Res. 2015; 14: 3322-35.

17. Fagone, P.; Jackowski, S. Phosphatidylcholine and the CDP-choline cycle. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 2013; 183: 523-32.

18. Borghese B., Mondon F., Noel J.-C., Fayt I., Mignot T.-M., Vaiman D. et al. Research Resource: Gene Expression Profile for Ectopic Versus Eutopic Endometrium Provides New Insights into Endometriosis Oncogenic Potential. Mol Endocrinol; 2008, 22: 2557-62.

19. Pradas I., Huynh K., Cabre R., Ayala V., Meikle P.J., Jove M., et al. Lipidomics reveals a tissue-specific fingerprint. Front Physiol. 2018; 9: 1-17.

20. Grandl M., Konovalova T., Id S.W., Orso E., Liebisch G., Schmitz G. Phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine plasmalogens in lipid loaded human macrophages; 2018: 1-21.