Морфологические и иммунногистохимические особенности полипов эндометрия в разновозрастных группах

Резюме

Важным фактором в развитии полипов эндометрия является ряд механизмов: наличие абсолютной или относительной гиперэстрогении и не до конца определенная роль инфекции, а также их влияние друг на друга. Поиск патогенетически обусловленных подходов, направленных на профилактику рецидивирования полипов эндометрия, является актуальной задачей.

Ключевые слова:полип эндометрия, инфекция, гормональные нарушения

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Для цитирования: Багдасарян Л.Ю., Пономарев В.В., Дряева Л.Г., Карахалис Л.Ю. Морфологические и иммунногистохимические особенности полипов эндометрия в разновозрастных группах // Акушерство и гинекология: новости, мнения, обучение. 2020. Т. 8, № 1. С. 30-37. doi: 10.24411/2303-9698-2020-11004

Гистероскопия остается "золотым стандартом" диагностики полипов эндометрия [1, 2]. Она позволяет определить размеры полипов, их число, дать сосудистые характеристики [1]. Техника кюретажа, которая проводится после дилатации, часто приводит к фрагментации полипов, тем самым вызывая трудности диагностики [3, 4]. Однако, несмотря на слепой забор, гистероскопия продолжает использоваться в гинекологии для диагностики и лечения полипов эндометрия (ПЭ), а также для получения гистологической и морфологической характеристики эндометрия и полипов эндометрия, а также проведения иммуногистохимических исследований. Все это направлено на выбор адекватной тактики профилактики рецидивов полипов эндометрия.

Цель исследования - оценить морфологические и иммунногистохимические особенности эндометрия и полипов эндометрия у пациенток возраста репродукции и перименопаузы для выбора адекватной терапии, направленной на профилактику рецидивов.

Материал и методы

В 1-ю группу вошли пациентки возраста репродукции (n=90) - их средний возраст составил 36,078±6,145 года при Me=37,0, верхние и нижние квартили [33; 41]; во 2-ю - пациентки перименопаузального возраста (n=42), их средний возраст - 53,548±6,153 года при Me=52,0; [49; 57]. Проведена морфологическая оценка в совокупности с иммунногистохимическими (ИГХ) исследованиями. Гистероскопию выполняли аппаратом KARL STORZENDOSCOPE (производитель "Карл Шторц ГмбХ и Ко", Германия) за 3-5 дней до менструации, перед удалением полипа и получением соскоба эндометрия, после манипуляции. Полип удаляли при помощи резектоскопа монополярного RICHARD WOLF (производитель "Рихард Вольф ГмбХ", Германия) с дальнейшим выскабливанием цервикального канала и полости матки.

Для морфологического и ИГХ-исследования соскоб предварительно отмывали от крови, фиксировали в 10% забуференном растворе формалина в течение 16-18 ч. После стандартной гистологической проводки заключали в парафин и делали срезы 3-4 мкм для стандартного окрашивания (гематоксилином и эозином) и ИГХ-исследования.

Хронический эндометрит рассматривается как аутоиммунный процесс, при котором имеется инфильтрация клеток эндометрия NK-клетками, В-лимфоцитами, активированными лимфоцитами [HLA-DR(II)+]. Методом ИГХ с клинико-морфологическим обследованием, определяли показатели местного иммунитета: количество лимфоцитов, экспрессирующих маркеры естественных киллерных клеток CD56+, CD16+ и маркеры активации HLA-DR(II)+; их подсчитывали в световом микроскопе при увеличении объектива х40, окуляра х10 в трех полях зрения:

при количестве клеток, экспрессирующих CD56+, CD16+, HLA-DR(II)+, от 0 до 10 в поле зрения диагностируют отсутствие эндометрита;

при количестве клеток, экспрессирующих CD56+, выше 10 и при количестве клеток, экспрессирующих CD16+ и HLA-DR(II)+, от 0 до 10 в поле зрения диагностируют аутоиммунный хронический эндометрит;

при количестве клеток, экспрессирующих CD56+, CD16+, HLA-DR(II)+, выше 10 в поле зрения диагностируют обострение аутоиммунного хронического эндометрита;

при количестве клеток, экспрессирующих, CD16+ и HLA-DR(II)+, выше 10 и при количестве клеток, экспрессирующих CD56+, от 0 до 10 в поле зрения диагностируют хронический эндометрит с обострением или острый эндометрит;

при количестве клеток, экспрессирующих CD16+, CD56+, выше 10 и при количестве клеток, экспрессирующих HLA-DR(II)+, от 0 до 10 в поле зрения диагностируют хроническое воспаление с аутоиммунным компонентом, но без активации процесса;

при количестве клеток, экспрессирующих, CD16+, выше 10 и при количестве клеток, экспрессирующих HLA-DR(II)+, от 0 до 10 в поле зрения диагностируют хронический эндометрит [5, 6].

Парафиновые срезы также обрабатывали по стандартной методике, используя мышиные моноклональные антитела к эстрогеновым рецепторам (ЭР) (клон 1D5 DACO, США) и прогестероновые рецепторы (ПР) (клон 1А6 DACO, США). Для визуализации реакции использовали пероксидазный универсальный набор LSAB+kit (Daco, США). С целью изучения интенсивности рецепции к прогестерону и эстрогенам в ядрах клеток желез эндометрия и стромы использовали метод гистологического счета H-score по формуле

HS=1a + 2b + 3с,

где а - процент слабо окрашенных клеток; b - процент умеренно окрашенных клеток; с - процент сильно окрашенных клеток; 1, 2, 3 - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах.

Степень выраженности экспрессии ЭР и ПР расценивали так: 0-10 баллов - отсутствие экспрессии; 11-100 баллов - слабая экспрессия (+); 101-200 баллов - умеренная экспрессия (++); 201-300 баллов - выраженная экспрессия (+++).

Методика H-score описана в работе R.A. McClelland и соавт. [7].

Результаты

При проведении гистероскопии, как и при гистологическом подтверждении, наличие полипа эндометрия в обеих группах подтверждалось не во всех случаях (рис. 1).

Гистологическое подтверждение наличия ПЭ в 1-й группе получено у 73 (81,11%) пациенток и во 2-й группе у 31 (73,81%) пациентки (р=0,34). При этом гистологический анализ в 1-й группе соответствовал пролиферативному эндометрию у 48 (53,33%) пациенток и во 2-й группе - у 36 (85,71%) пациенток; секреторный эндометрий наблюдался у 36 (40,0%) пациенток 1-й группы и у 5 (11,91%) пациенток 2-й группы. Смешанный эндометрий наблюдался у 6 (6,67%) пациенток 1-й группы и у 1 (2,38%) во 2-й группе. При проведении гистологического исследования биоптатов были выделены хронический воспалительный процесс, гиперплазия эндометрия, аденомиоз (табл. 1). Гистологическая классификация Всемирной организации здравоохранения (2014) рассматривает ПЭ как вариант гиперпластического процесса. Необходимо отметить, что в обеих группах наибольшее число рецидивов пришлось на долю железисто-фиброзных полипов: они были отмечены у 11 (52,38%) пациенток в 1-й группе и у 14 (87,5%) пациенток во 2-й группе. Железистые полипы наблюдались у 12 (25,0%) пациенток из 1-й группы и у 3 (33,33%) пациенток из 2-й, фиброзные - у 1 (16,67%) пациентки из 2-й группы. Все случаи рецидивов распределились следующим образом: железистые полипы - 26,32%; железисто-фиброзные - 62,16%; фиброзные - 16,67%.

На рис. 2 представлен полип эндометрия с сосудистой ножкой, характерный для репродуктивного возраста, а на рис. 3 - полип эндометрия переходного типа, характерный для периода перименопаузы.

Полип эндометрия переходного типа (см. рис. 3) представлен плотной стромой с лимфоцитарной инфильтрацией, формированием лимфоидных фолликулов, что говорит об онкологической настороженности. При полипах переходного, перименопаузального и менопаузального периодов необходимо удалять и исследовать не только сам полип, но и соскобы слизистой цервикального канала и полости матки.

Между данными полученных гистологических ответов состояния эндометрия и объемами ПЭ имеется корреляционная связь: в 1-й группе отрицательная между объемом ПЭ и данными гистологии за аденомиоз, r= -0,317; во 2-й группе - положительная между объемом ПЭ и хроническим эндометритом, r=0,323, и аденомиозом, r=0,396.

Таким образом, у каждой 3-й пациентки возраста репродукции был хронический эндометрит, аналогичная картина отмечалась и у пациенток перименопаузального возраста; аденомиоз значительно чаще (в 4,4 раза) выявлялся у пациенток возраста репродукции, чем в перименопаузальном периоде. Гиперплазия эндометрия встречалась одинаково нечасто: 3,33% случай в 1-й группе и 2,38% - во 2-й.

Многочисленные исследования ПЭ позволяют рассматривать их как неоднородную группу в плане патоморфологического отношения. Согласно морфоструктуре, полипы делят на покрытые функциональным слоем, при этом железистый компонент претерпевает циклические изменения; возникающие из базального слоя эндометрия, что имеет определенное сходство с железистой, железисто-кистозной и аденоматозной гиперплазией [8, 9]. Железистые (аденоматозные) полипы характеризуются преобладанием железистого компонента над стромальным, который представлен рыхлой соединительной тканью, клетками и клубками кровеносных сосудов в основании и ножке, железы расположены разнонаправленно, неодинаковой длины, они нефункционирующие. Железисто-фиброзные полипы содержат неправильной формы и различной длины железы с неравномерным расположением, более плотной стромой к ножке полипа, приблизительно в одинаковых количествах. Практически все полипы характеризуются наличием склерозированных стенок сосудов. Фиброзные полипы представлены соединительнотканными образованиями, практически с отсутствием желез. Аденоматозные полипы характеризуются интенсивным размножением клеток железистого эпителия, нарушением кровообращения, воспалением и очагами некроза. Сегодня ПЭ это инфекционно-воспалительный процесс на фоне действия половых гормонов [8, 9].

В последнее время инфекционным и иммунным факторам отводится особая роль в развитии ПЭ. При этом мы видим, что воспалительная теория подтверждается данными за наличие хронического эндометрита как по картине, полученной при гистероскопии, так и по данным гистологии, полученным нами при удалении ПЭ и выскабливании полости матки. Хроническое воспаление активирует локальные механизмы иммунитета в эндометрии, приводя к клеточному дисбалансу. Это способствует увеличению содержания клеток киллеров (CD16+ и CD56+), повышению HLA-DR(II)+ [10, 11]. Увеличение экспрессии ИГХ-показателей, в том числе CD16+, определяется наличием острых и хронических заболеваний, в данном случае эндометрита. Хронический эндометрит может протекать при отсутствии клинических проявлений, приводя к репродуктивным нарушениям и вызывая бесплодие. Развивающаяся при этом воспалительная реакция является универсальным способом защиты макроорганизма. Повышение CD16+ является адаптацией иммунной системы, которая борется с возбудителем воспалительной реакции. Чем более выражена экспрессия, тем выше CD16+ -островоспалительные процессы сопровождаются повышением. Нами выявлена высокая корреляция между экспрессией CD16+ и ПЭ во 2-й группе - r=0,814. CD16+ и CD56+ используются, как правило, вместе, они являются натуральными киллерами, их повышение говорит об избытке бактериального или вирусного антигена. Возможно развитие хронического эндометрита по разным клинико-морфологическим формам, в том числе полиповидное разрастание или лимфофолликулярный эндометрит можно расценить как аутоиммунное воспаление [6, 12].

Нами выявлено увеличение количества иммунокомпетентных клеток CD16+ и CD56+. Превышение их более выражено было в 1-й группе, во 2-й группе они или вообще отсутствовали, или их количество было нормальным. Повышение CD16+ в 1-й группе было у 57 (63,33%) пациенток, а CD56+ -у 65 (72,22%) пациенток. Во 2-й группе повышение было только CD16+ у 42,86%, при этом у 11 (26,19%) пациенток не отмечено экспрессии. Именно повышение CD16+ приводит к адаптации иммунной системы, которая борется с возбудителем воспалительной реакции. Островоспалительные процессы сопровождаются повышением экспрессии CD16+. У пациенток 2-й группы повышение экспрессии CD16+, по всей видимости, связано с развитием постменопаузальной атрофии эндометрия, которое усиливается снижением кровообращения в подэпителиальных капиллярах [13]. У 14 (33,33%) пациенток экспрессия CD56+ была отрицательной, у 12 (28,57%) не было экспрессии. Мы определили высокую корреляцию между экспрессией CD16+ и наличием ПЭ во 2-й группе (перименопаузальный возраст) - r=0,814. Таким образом, мы видим разную степень иммунной дезадаптации в структурах эндометрия в группе репродукции (1-я группа) и в группе перименопаузального возраста (2-я группа). Большие гранулярные лимфоциты, несущие маркеры CD16+ и CD56+, характеризуют как раз степень распространения хронического воспаления эндометрия, которое определяется также и HLA-DR(II)+ показателями в группах.

Уровень HLA-DR(II)+ также является показателем локального иммунитета, который используется в совокупности с увеличением CD16+ и CD56+ как маркер обострения аутоиммунного хронического эндометрита [14]. Учитывая исследования В.Н. Эллиниди, Н.М. Калининой (2001), нами проведена оценка клинико-морфологического обследования ИГХ-методом подсчета числа экспрессирующих клеток CD16+ CD56+, HLA-DR(II)+ (табл. 2) для определения характера воспаления хронического эндометрита.

Из возможных 6 вариантов сочетаний в нашем исследовании было определено 2: CD16+, CD56+, HLA-DR(II)+ выше 10, которое характеризует обострение хронического аутоиммунного эндометрита (ХАЭ) и в 1-й группе составило 53,33%. На втором месте в 1-й группе - хронический эндометрит с обострением или острый эндометрит, на долю которого приходится 46,67%. Во 2-й группе наоборот: хронический эндометрит с обострением или острый эндометрит занимает первое место и на его долю приходится 69,05%, на втором месте пациентки с обострением хронического аутоиммунного эндометрита (30,95%). На рис. 4 и 5 представлены ИГХ-характеристики для большей части пациенток 1-й группы (рис. 4) - обострение ХАЭ и большей части пациенток 2-й группы (рис. 5) - хронический эндометрит с обострением.

Таким образом, отсутствие негативной экспрессии CD56+ во 2-й группе, в отличие от 1-й группы (27,78%), определило преимущественно наличие хронического эндометрита, что подтверждается ранговыми корреляциями (r=0,538). В 1-й группе данная корреляционная связь слабее - r=0,318.

Так как CD56+-лимфоциты ответственны за продукцию провоспалительных цитокинов, а CDl6+-лимфоциты обладают выраженным цитотоксическим (киллерным) потенциалом, происходящие в эндометрии нарушения могут способствовать образованию ПЭ на фоне хронического аутоиммунного эндометрита. Учитывая выявленные нарушения параметров местного иммунитета у женщин с ХАЭ, препарат выбора должен обладать противовоспалительным и иммуномодулирующим эффектами.

Исследование рецепторного гормонального статуса по экспрессии рецепторов к эстрогену (ER) и прогестерону (PR) позволяет изучить нарушения в соотношениях процессов пролиферации и функционирования эндометрия, способствующих подбору адекватной терапии, направленной на реабилитацию и профилактику рецидивирования ПЭ.

Наши исследования показали, что доля ядер, экспрессирующих ER+++ в железистом эпителии у пациенток 1-й группы, составила 100% (90 пациенток), а во 2-й группе -73,81% (31 пациентка), что характеризует структуру отличия между группами (рис. 6). Выявлена умеренная экспрессия ER в строме эндометрия. Доля ядер, экспрессирующих ER+++ в строме эндометрия, в 1-й группе составила 63,33% (57 пациенток), во 2-й группе 66,67% (28 пациенток). Отрицательная экспрессия ER во 2-й группе была у 11 (26,19%) пациенток. На рис. 6 показан уровень экспрессии в строме ER.

Доля ядер, экспрессирующих PR+++ в железистом эпителии, составила 63,33% (57 пациенток) в 1-й группе и 73,81% (31 пациентка) во 2-й группе; доля ядер, экспрессирующих PR++, в 1-й группе составила 36,67% (33 пациентки), во 2-й группе их не было. Но во 2-й группе были пациентки с отрицательным уровнем экспрессии PR -11 (26,19%) пациенток, что изображено на рис. 7. Доля ядер, экспрессирующих PR+++ в строме, в 1-й группе была 63,33% (57 пациенток), во 2 группе - 73,81% (31 пациентка). Доля ядер, экспрессирующих PR++, была только у пациенток с полипами 1-й группы - у 33 (36,67%) пациенток. А отсутствовала доля ядер, экспрессирующих PR стромы, во 2-й группе у 11 (26,19%) человек (рис. 7).

Имеется высокая корреляционная связь между долей ядер, экспрессирующих ER в эпителии желез, и наличием полипов эндометрия, которая наиболее выражена во 2-й группе - r=0,741.

Учитывая полученные данные за обострение ХАЭ, нами проведена терапия в 1-й группе у 32 пациенток с преимущественным назначением препаратов, направленных на коррекцию аутоиммунных нарушений. Бовгиалуронидаза азоксимер назначается в гинекологии при воспалительных заболеваниях органов малого таза (ВЗОМТ) [15, 16] с целью профилактики гиперплазии соединительной ткани. Проведен курс терапии: свечи ректальные по 1 суппозиторию (3 тыс. МЕ) 1 раз в сутки на ночь с перерывом в 2 дня, на курс 20 свечей. Панавир-интим спрей, обладающий противовоспалительным свойством, повышающий показатели иммунной системы, также назначался пациенткам 1-й группы по схеме: по 3 "впрыска" 4-5 раз в сутки в течение 10 дней.

Некоторые ученые считают, что ПЭ возникают на фоне изменений экспрессии эстрогеновых рецепторов, которые приводят к локальному росту эндометрия в ответ на повышенный уровень эстрогенов [17-19]. Это может быть связано с гиперчувствительностью отдельных участков эндометрия. Поэтому нами проводилась гормональная реабилитация: назначались в течение 6 мес гестагены (дидрогестерон) или в дозе 20 мг по контрацептивной схеме с 5-го по 25-й день менструального цикла (МЦ), или по схеме с 11-го по 25-й день МЦ для лечения бесплодия при соответствующих жалобах пациенток. Дидрогестерон снижает риски гиперплазии эндометрия и/или канцерогенеза. При необходимости контрацепции назначали комбинированные оральные контрацептивы (КОК). При этом выбор гестагенного компонента КОК в виде диеногеста был обусловлен его свойствами. Известно, что диеногест обладает иммуномодулирующими, противовоспалительными и другими необходимыми для лечения ХАЭ показаниями.

Во 2-й группе назначалась терапия ректальными свечами бовгиалуронидаза азоксимер по 1 суппозиторию (3 тыс. МЕ) 1 раз в сутки на ночь с перерывом в 2 дня, на курс 20 свечей с последующим назначением или агонистов гонадотропин-рилизинг гормонов (а-ГнРГ), или КОК, или гестагенов в непрерывном режиме до 6 мес с последующим назначением КОК либо менопаузальной гормонотерапии (МГТ).

Результаты ИГХ-анализов через 6 мес в 1-й группе продемонстрировали у 27 пациенток из 32 (84,38%) отсутствие ХАЭ, на рис. 8 показаны результаты ИГХ-исследования.

Терапия во 2-й группе у 9 из 17 (52,94%) пациенток также продемонстрировала отсутствие данных за хронический эндометрит с обострением или острый эндометрит. При этом в обеих группах отмечена нормализация уровня рецепторов и ER, и PR.

Таким образом, комплексная терапия после полипэктомии у пациенток разновозрастных групп должна быть направлена как на купирование ХАЭ и/или хронического эндометрита с обострением, так и на профилактику гиперпластических процессов, что у подавляющего большинства пациентов (в 1-й группе у 84,38% и во 2-й группе у 52,94%) излечивает ВЗОМТ и при наблюдении в течение 12 мес профилактирует гиперплазию и/или ПЭ.

Литература

1. American Association of Gynecologic Laparoscopists. AAGL practice report: practice guidelines for the diagnosis and management of endometrial polyps // J. Minim. Invasive Gynecol. 2012. Vol. 19 (1). P. 3-10.

2. Lo K.W.K., Yuen P.M. The role of outpatient diagnostic hysteroscopy in identifying anatomic pathology and histopathology in the endometrial cavity // J. Am. Assoc. Gynecol. Laparoscop. 2000. Vol. 7 (3). P. 381385.

3. Svirsky R., Smorgick N., Rozowski U. et al. Can we rely on blind endometrial biopsy for detection of focal intrauterine pathology? // Am J Obstet Gynecol. 2008.Vol. 199 (2). Р. 115.e1-115.e3.

4. Bettocchi S., Ceci O., Vicino M., Marello F., Impedovo L., Selvaggi L. Diagnostic inadequacy of dilatation and curettage // Fertil. Steril. 2001. Vol. 75 (4). P. 803-805.

5. Калинина Н.М. Хронический эндометрит. Подходы к диагностике и терапии // Consilium Medicum. 2015. Т. 17, № 6.

6. Эллиниди В.Н., Калинина Н.М. Иммуноморфология эндометрия. Лечение бесплодия: нерешенные проблемы. Саратов, 2001. С. 158162.

7. McClelland R.A., Wilson D., Leake R. et al. A multicenter study into the reliability of steroid receptor immunocytochemical quantification // Eur. J. Cancer. 1991. Vol. 27 (6). P. 711-715.

8. Гинекология: учебник / под ред. В.Е. Радзинского, А.М. Фукса. М. : ГЭОТАР-Медиа, 2014. 1000 с.

9. Гинекология: учебник / под ред. ГМ. Савельевой, В.Г. Бреусенко. М. : ГЭОТАР-Медиа, 2014. 432 с.

10. Хардиков А.В., Газазян М.Г., Иванова О.Ю., Лунева И.С. Неспецифические хронические воспалительные заболевания органов малого таза и перинатальные проблемы // Женское здоровье и репродукция: сетевое издание. 2019. № 4 (35).

11. Савченко Т.Н., Воропаева Е.А., Батиян Т.С., Мельников А.В., Стрыгина В.А. Состояние микробиоценоза и локального иммунитета у пациенток с полипами эндометрия в постменопаузе // Доктор.Ру. 2011. № 9. С. 33-38.

12. Овчарук Э.А., Хадарцева К.А., Овчарук В.Л. Хронические аутоиммунные эндометриты диагностика и лечение (краткое сообщение) // Вестник новых медицинских технологий (электронное издание). 2013. № 1. Публикация 2-198. URL: http://medtsu.tula.ru/VNMT/Bulletin/E2013-1/4589.pdf (дата обращения 02.12.2013).

13. Nieminen T.T., Gylling A., Abdel-Rahman W.M., et al.] Molecular analysis of endometrial tumorigenesis: importance of complex hyperplasia regardless of atypia // Clin. Cancer Res. 2009. Vol. 15, N 18. P. 5772-5783.

14. Овчарук Э.А., Хабаров С.В., Хадарцева К.А. Локальное введение липосомальной эмульсии "Фламена" в лечении хронического эндометрита с аутоиммунной дезадаптацией // Вестник новых медицинских технологий. 2018. Т. 25, № 3. С. 87-95.

15. Баранов И.И., Кукарская И.И., Карахалис Л.Ю., Суханов А.А., Виницкий А.А. Комплексный подход к лечению больных с воспалительными заболеваниями органов малого таза // Акушерство и гинекология: новости, мнения, обучение. 2018. № 4 (22). С. 65-71.

16. Суханов А.А., Карахалис Л.Ю., Кукарская И.И., Баранов И.И. Многокомпонентная терапия больных с воспалительными заболеваниями органов малого таза // Акушерство и гинекология. 2018. № 12. С. 125-131.

17. Махина Е.В., Пичигина А.К., Колдышева Е.В., Молодых О.П., Лушникова Е.П. Диагностическая и прогностическая значимость оценки пролиферативной активности клеточных популяций эндометрия при гиперпластических и неопластических процессах // Фундаментальные исследования. 2014. № 10 (2). С. 420-427.

18. Сатаров Ш.Н., Коган Е.А., Саркисов С.Э., Мамиконян И.О., Бойко М.А., Гюрджян С.А. Молекулярные механизмы патогенеза полипов эндометрия в постменопаузе // Акушерство и гинекология. 2013. № 6. С. 17-22.

19. Савельева Г.М., Бреусенко В.Г., Карева Е.Н., Голова Ю.А., Тихонов Д.А., Ивановская Т.Н. Патогенез полипов эндометрия у пациенток в пре- и постменопаузе. Экспрессия генов рецепторов эстрадиола и прогестерона в их ткани // Акушерство и гинекология. 2015. № 3. С. 33-39.