Место молекулярно-генетических методов в мониторинге и диагностике оппортунистических инфекций, в том числе связанных с оказанием медицинской помощи, у пациентов неонатального и акушерско-гинекологического профиля

Резюме

Цель исследования - предложить технологию мониторинга и лечения бактериальных инфекций, вызванных полирезистентными условно-патогенными микроорганизмами, на основе молекулярно-генетических методов исследования в перинатальных центрах.

Материал и методы. Проведен анализ мировой и отечественной литературы, изучены результаты мировых и отечественных многоцентровых исследований, выполнен анализ собственных данных видовой принадлежности основных оппортунистических патогенов в госпитальной среде, анализ данных о механизмах, составе и распространенности генов резистентности к антибиотикам с учетом особенностей контингента перинатальных центров. Создана коллекция полирезистентных штаммов с различными вариантами фено- и генотипической резистентности, проведена валидация технологии in vitro на штаммах микроорганизмов и биологическом материале от новорожденных и женщин.

Результаты. С учетом особенностей контингента перинатальных центров разработан перечень наиболее значимых молекулярно-генетических маркеров, необходимых для эффективного лечения госпитальных инфекций и профилактики распространения полирезистентных штаммов микроорганизмов. Технология позволяет выявлять ДНК условно-патогенных микроорганизмов и эпидемиологически значимые маркеры резистентности к β-лактамным антибиотикам и гликопептидам у женщин репродуктивного возраста и новорожденных методом количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Сформирован алгоритм выбора оптимальной тактики ведения пациентов неонатального профиля.

Заключение. Использование предложенной технологии позволит получить следующий результат: в короткие сроки (в течение 2 ч) выполнить идентификацию основных возбудителей госпитальных оппортунистических инфекций и выявить маркеры их резистентности к β-лактамным антибиотикам и гликопептидам у женщин репродуктивного возраста и новорожденных. На основе полученных данных можно оптимизировать антибактериальную терапию, проводить санитарные и противоэпидемические мероприятия, в том числе по изоляции и маршрутизации пациентов.

Ключевые слова:оппортунистические инфекции, гены резистентности, молекулярно-генетическая диагностика, ПЦР-исследование, перинатальная медицина, клиническая лабораторная диагностика

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Припутневич Т.В., Трофимов Д.Ю. Сбор и обработка материала - Любасовская Л.А., Гордеев А.Б., Донников А.Е. Статистическая обработка данных - Сердюкова Д.М., Быстрицкий А.А., Шабанова Н.Е. Написание текста - Сердюкова Д.М., Любасовская Л.А. Редактирование - Припутневич Т.В., Трофимов Д.Ю.

Для цитирования: Припутневич Т. В.,Любасовская Л. А.,Трофимов Д.Ю.,Донников А. Е.,Быстрицкий А. А., Гордеев А. Б., Сердюкова Д.М., Шабанова Н.Е. Место молекулярно-генетических методов в мониторинге и диагностике оппортунистических инфекций, в том числе связанных с оказанием медицинской помощи, у пациентов неонатального и акушерско-гинекологического профиля // Акушерство и гинекология: новости, мнения, обучение. 2020. Т. 8, № 1. С. 53-60. doi: 10.24411/2303-9698-2020-11007

Эффективное лечение многих инфекционных заболеваний невозможно без данных о резистентности возбудителя к антимикробным препаратам (АМП). Наиболее широко применяемый метод - фенотипическое определение чувствительности на основе измерения уровня минимальной подавляющей концентрации (МПК), а также его упрощенная модификация - диско-диффузионный метод. С помощью данных методов можно оценить подавляющую способность АМП в отношении конкретного штамма микроорганизма независимо от механизма действия и генов, его кодирующих. В то же время к недостаткам данной методики можно отнести увеличение длительности микробиологического исследования минимум на 1 сут, а также отсутствие возможности эпидемиологического маркирования штаммов по генам резистентности, чтобы можно было отслеживать пути их циркуляции в стационаре. Наряду с этим нередко при резистентности у микроорганизма к антибиотику in vitro не удается получить клинический эффект от применения препарата. Это может быть связано как со свойствами данного микроорганизма, например с формированием биопленок [1, 2], так и с присутствием в ассоциации микроорганизмов, несущих гены резистентности в столь незначительном количестве, что при фенотипическом определении чувствительности они не выявляются, но в случае назначения антимикробной терапии под действием селективного пресса антибиотика чувствительные варианты бактериальных клеток одного вида погибают, а резистентные, получив конкурентное преимущество, могут дать новый вираж инфекции, вызванной возбудителем с новыми свойствами. Таким образом, невозможность быстрого выявления устойчивых штаммов условно-патогенных бактерий приводит к применению неадекватных схем противомикробной терапии и несет в себе риск распространения резистентных штаммов.

Как и ранее, условно-патогенные микроорганизмы (УПМ) являются основными возбудителями послеродовых инфекционных осложнений и раннего неонатального сепсиса, но теперь УПМ становятся возбудителями и госпитальных оппортунистических инфекций с присущими им современными новыми свойствами - множественной лекарственной устойчивостью. К приоритетным направлениям в диагностике инфекций, в частности среди особого контингента пациентов - беременных, родильниц и новорожденных, можно отнести быстроту выявления возбудителя и определение его свойств.

Как правило, на рынке представлены диагностические продукты для выявления отдельных возбудителей нозокомиальных и оппортунистических инфекций и генов, ассоциированных с резистентностью к антимикробным препаратам. При этом праймеры к генам резистентности чаще всего входят в состав отдельных тестов, и каждый из них позволяет определить резистентность к отдельным группам препаратов. Например, для идентификации генов металло-β-лактамаз, принадлежащих к наиболее распространенным группам - VIM, IMP и основных подгрупп карбапенемаз OXA-типа, разработан ряд методов с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) [3].

Кроме того, существуют комплексные способы выявления маркеров резистентности микроорганизмов к антимикробным препаратам. К примеру, существует метод мультиплексной ПЦР в режиме реального времени c последующим анализом кривых плавления полученных ампликонов для идентификации генов 5 групп металло-β-лактамаз [4]. Но, как правило, метод мультиплексной ПЦР не позволяет одновременно детектировать большое количество генов [5]. Другая группа способов идентификации генов, обусловливающих резистентность микроорганизмов к АМП, основана на методе гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах [5]. Существенную долю российского рынка диагностических продуктов для выявления с помощью ПЦР генов, ассоциированных с резистентностью к антимикробным препаратам, занимают продукты 3 компаний: ООО "Интерлабсервис" (Россия), НПФ "Литех" (Россия) и компании Cepheid (США). ООО "Интерлабсервис" предлагает отдельные наборы для ПЦР-идентификации генов резистентности к метициллину и генов ряда карбапенемаз (VIM, IMP, NDM, KPC, OXA-48). НПФ "Литех" предлагает наборы для определения генов β-лактамаз классов TEM, CTX-M, SHV-5, SHV-12, VIM, NDM, OXA-48, а также генов резистентности к метициллину (mecA) и ванкомицину (vanA, vanB). Компания Cepheid предлагает детектирующие амплификаторы серии Gene Expert, которые работают с тест-наборами разных типов. Тест-наборы позволяют идентифицировать гены резистентности, относящиеся к следующим группам: β-лактамазы (классов IMP-1, NDM, OXA-48, VIM, KPC), гены резистентности к метициллину (mecA) и ванкомицину (vanA, vanB).

Существующие методы молекулярно-биологической диагностики позиционируются как тесты для усредненного пациента, т.е. они не учитывают специфику выявления подобных заболеваний у женщин репродуктивного возраста, беременных и родильниц. Поэтому представляется целесообразной и практически актуальной для использования в клинической практике разработка набора маркеров резистентности возбудителей нозокомиальных и оппортунистических инфекций у пациентов неонатального и акушерскогинекологического профиля.

Цель исследования - предложить технологию мониторинга и лечения бактериальных инфекций, вызванных полирезистентными УПМ, на основе молекулярно-генетических методов исследования в перинатальных центрах.

Материал и методы

В качестве технологической основы для мониторинга и диагностики инфекций у пациентов акушерско-гинекологического профиля и новорожденных был выбран метод количественной ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени, обладающий высокой специфичностью и чувствительностью. ПЦР выполняется на приборах, обеспечивающих техническую возможность постановки реакции ПЦР в режиме реального времени. Для обследования у женщин используют соскобы эпителиальных клеток из влагалища (заднебоковые своды), цервикального канала, биоптат эндометрия, метроаспират, содержимое абсцесса, экссудат брюшной полости, кровь, мочу; у новорожденного - кал, зев, кровь, моча, отделяемое глаз, содержимое везикулы, отделяемое пупочной ранки, содержимое венозного катетера. Биоматериал, взятый одноразовым стерильным зондом, помещают в одноразовую пластиковую пробирку с транспортной средой для реакции ПЦР. Из взятого биоматериала стандартными процедурами выделяют суммарные нуклеиновые кислоты.

Для проведения ПЦР используют детектирующие амплификаторы. После прохождения амплификации по показателю индикаторного цикла программное обеспечение прибора отмечает наличие общей бактериальной массы и присутствие в анализируемом образце ДНК избранных генов резистентности. Реакция выполняется с наборами реагентов, обеспечивающими возможность исследования конкретных микроорганизмов: 1) реагенты для определения наличия общей массы бактериальной ДНК; 2) реагенты для определения бактерий, относящихся к 8 таксонам (семейство: Enterobacteriaceae, роды: Staphylococcus, Enterococcus, Acinetobacter, комплекс видов: Burkholderia cepacia, виды: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia); 3) реагенты для определения генов резистентности; 4) реагенты для определения геномной ДНК человека (ген рецептора гормона роста).

Результаты

Предлагаемая технология предназначена для выявления ДНК УПМ и избранных маркеров резистентности к β-лактамным антибиотикам и гликопептидам у женщин репродуктивного возраста и новорожденных методом количественной ПЦР в режиме реального времени. Предлагается идентифицировать следующие показатели в биоматериале (табл. 1): определение геномной ДНК человека (гена рецептора гормона роста) для контроля забора материала, общей бактериальной массы, специфической ДНК микроорганизмов, относящихся к 8 таксонам (семейство: Enterobacteriaceae, роды: Staphylococcus, Enterococcus, Acinetobacter, комплекс видов: Burkholderia cepacia, виды: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia) и 15 маркерных локусов, позволяющих выявлять гены резистентности УПМ к β-лактамным антибиотикам и гликопептидам.

В результате сопоставления полученных данных с предлагаемыми критериями (табл. 2) можно определить чувствительность микроорганизмов к β-лактамным антибиотикам и гликопептидам и выбрать оптимальную тактику лечения для конкретного пациента.

Полученные при исследовании биологического материала данные позволяют не только эмпирически назначить адекватную антимикробную терапию, но и проводить маркирование пациентов в отделении и ранжировать их по степени биологической опасности для планирования маршрутизации пациентов. Современная эпидемиология должна основываться на молекулярно-генетических методах, т.е. стать молекулярной эпидемиологией. Выбор тактики ведения пациента на примере отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных (ОРИТН) представлен на рисунке.

Так, при поступлении новорожденного в ОРИТ из родильного зала обследования методом ПЦР на госпитальные патогены не требуется, при наличии признаков врожденной инфекции необходима диагностика вирусных и внутриутробных бактериальных инфекций и стартовая схема антимикробной терапии для внутриутробных инфекций, включающая ампициллин (или защищенный аминопенициллин) в комбинации с аминогликозидом (гентамицин, нетилмицин). Изоляция не требуется.

При манифестации признаков инфекции у ребенка после 72 ч пребывания в ОРИТН или новый вираж инфекции, а также при переводе ребенка в отделение из другого стационара требуется обязательное обследование на госпитальные патогены и гены резистентности. При получении положительного результата необходима немедленная изоляция пациента для исключения колонизации полирезистентными УПМ окружающих новорожденных. Если признаков инфекции нет, необходимо ограничиться изоляцией, если признаки инфекции присутствуют, проводить коррекцию антимикробной терапии в соответствии с табл. 2.

Обсуждение

Многофакторность взаимодействия микроорганизмов с организмом человека и интенсивное развитие новых методических возможностей для микробиологических исследований диктует необходимость разработки инновационных комплексных диагностических инструментов, позволяющих оценить генетические свойства отдельно взятых клинически значимых штаммов УПМ, в частности выявлять гены резистентности возбудителей нозокомиальных оппортунистических инфекций к антимикробным препаратам. Получение данных о резистентности возбудителей нозокомиальных оппортунистических инфекций существенно повышает эффективность лечения подобных заболеваний. В эпоху нарастания лекарственной устойчивости ответственность за использование антибиотиков приобретает первостепенное значение.

Классическим методом ("золотым стандартом") выявления резистентных штаммов УПМ является культуральное исследование с определением видовой принадлежности микроорганизма и индикацией маркеров резистентности. Однако этот метод предполагает обязательное выделение чистой культуры и дополнительное тестирование антибиотикорезистентности по фенотипическим признакам, что пролонгирует получение конечного результата до 2-3 сут в зависимости особенностей возбудителей и их состава.

Помимо культурального исследования существуют способы выявления резистентных штаммов с применением технологий молекулярной диагностики. В основе таких способов лежит метод ПЦР, суть которого состоит в том, что в исследуемый образец, предположительно содержащий тот или иной микроорганизм или ген, вносятся искусственно синтезированные нуклеотидные последовательности (праймеры), специфически комплементарные генетическому материалу искомого микроорганизма или гена. В процессе ПЦР при наличии искомого микроорганизма/гена нарастание концентрации специфических молекул ДНК происходит в геометрической прогрессии, и после 30-40 циклов она достигает значений, при которых возможна визуальная регистрация результатов реакции.

Предлагаемая технология представляет собой способ выявления маркеров резистентности к β-лактамным антибиотикам и гликопептидам у женщин репродуктивного возраста и новорожденных путем анализа ДНК микроорганизмов, а также для выявления ДНК УПМ и избранных маркеров резистентности к β-лактамным антибиотикам и гликопептидам. Она позволяет в течение короткого времени (несколько часов) идентифицировать любые микроорганизмы: аэробные и анаэробные; условно-патогенные и облигатно патогенные. Так, например, в соответствии с данными Европейских стандартов диагностики и лечения заболеваний, передаваемых половым путем (2004), чувствительность ПЦР в диагностике хламидийной инфекции составляет 70-95%, специфичность 97-99%. К достоинствам метода следует отнести возможность тестирования большого количества любых клинических образцов. Диагностическая ценность признана во всем мире и метод широко используется в лабораторной практике.

Представленная технология относится к области медицины: к акушерству, гинекологии, неонатологии, микробиологии, молекулярной генетике, клинической лабораторной диагностике, - и может быть использована для выявления основных возбудителей нозокомиальных оппортунистических инфекций и маркеров их резистентности к β-лактамным антибиотикам и гликопептидам для выбора оптимальной стратегии лечения пациентов в медицинских учреждениях акушерского, гинекологического и неонатологического профиля.

Заключение

Представленная технология может быть востребована сетью акушерских и гинекологических стационаров, перинатальными центрами, женскими консультациями, а также коммерческими медицинскими центрами и лабораториями. Кроме того, изобретение можно использовать в научно-исследовательской практике. Данная методика отличается тем, что предлагает комплексное решение, учитывающее специфику выявления инфекционных заболеваний, вызванных УПМ у женщин репродуктивного возраста и новорожденных. Технологи предполагает идентификацию как основных УПМ - возбудителей нозокомиальных оппортунистических инфекций, так и наиболее распространенных генов, обусловливающих резистентность УПМ к β-лактамным антибиотикам и гликопептидам. Кроме того, технология отличается уникальным набором предоставляемых показателей и включает аналитический компонент - алгоритм, позволяющий на основе результатов выбрать оптимальную стратегию лечения для каждого отдельно взятого пациента.

Литература

1. Руднов В.А., Бельский Д.В., Дехнич А.В. Инфекции в ОРИТ России: результаты национального многоцентрового исследования // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2011. Т. 13, № 4. С. 294-303.

2. Zhao G., Usui M.L. Biofilms and Inflammation in Chronic Wounds // Adv. Wound Care (New Rochelle). 2013. Vol. 2. Р. 389-399.

3. Ионов О.В., Никитина И.В., Бурменская О.В., Непша О.С., Трофимов Д.Ю., Донников А.Е.. Роль метода ПЦР в диагностике врожденных и нозокомиальных инфекций у новорожденных // Акушерство и гинекология. 2013. № 11. С. 59-64.

4. Pfeifer Y., Cullik A., Witte W. Resistance to cephalosporins and carbapenems in Gram-negative bacterial pathogens // Int. J. Med. Microbiol. 2010. Vol. 300. Р. 371-379.

5. Уляшова М.М., Халилова Ю.И., Рубцова М.Ю. и др. Олигонуклеотидный микрочип для идентификации генов карбапенемаз молекулярных классов A и D // Acta Naturae. 2010. № 2. С. 116-125.