Тезисы. Часть 1

Когда же и так ли необходимы молекулярно-генетические методы диагностики ДНК резус-фактора при беременности?

Абдрахманова Л.Р., Мусина Д.М., Гафурова Л.И., Чигвинцева П.Е.

Государственное автономное учреждение здравоохранения "Республиканская клиническая больница", 420000, г. Казань, Российская Федерация

When and whether moleculare genetic study of rhesus factor in pregnancy?

E-mail: labdrahmanova@yandex.ru

Материал и методы. С 2013 г. проводится исследование ДНК Rh-фактора плода методом мультипраймерной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием коммерческого набора DIA tom DNA Prep 100ЦР у беременных с Rh(-) принадлежностью крови и высоким риском хромосомной патологии плода по пренатальному скринингу I триместра параллельно с исследованием кариотипа плода и пренатального микроматричного анализа плода. Всего в МГК проведено 85 исследований. С 2016 г. в МГК проводится неинвазивное исследование фетальной ДНК Rh-фактора плода, свободно циркулирующей в крови беременной с Rh(-) принадлежностью крови с использованием диагностического набора "Тест-RhD плюс ООО -Тест - Ген". С 2016 г. проведено 86 неинвазивных исследований Rh-фактора плода по крови беременных с Rh(-) принадлежностью без Rh-антител и с Rh-иммунизацией - наличием Rh-антител 1:4-1:64.

Результаты. Первым по значению в прогнозе Rh-фактора плода имеет определение ДНК Rh-фактора плода при инвазивных методах - биопсии ворсин хориона (БВХ) и амниоцентезе у беременных с высоким риском хромосомной патологии и моногенных заболеваний плода. В МГК определено 51 плодов с Rh(+)- и 34 с Rh(-)-принадлежностью крови. При выявлении хромосомной патологии и тяжелого моногенного заболевания плода и Rh(+)-принадлежности плода рекомендовано введение антирезусного иммуноглобулина после прерывания беременности. Одним из последних инвазивных исследований Rh-фактора плода и высокого риска хромосомной патологии плода в МГК было проведено у беременной с ВИЧ-инфекцией, выявлена хромосомная патология плода - синдром Тернера, 45,ХО. Беременная направлена на прерывание беременности с рекомендацией введения антирезусного иммуноглобулина. Таким образом, наличие ВИЧ, гепатитов В и С у беременных не является противопоказанием для проведения данного исследования. C 2016 г. проведено 86 неинвазивных исследований фетальной ДНК Rh-фактора плода по крови беременных, в основном 2 групп: с наличием аномалий развития плода и Rh(-)-принадлежностью крови и Rh-иммунизацией, т.е. наличием титра Rh-антител от 1:4 до 1:64. У 67 беременных определена Rh(+), у 19 беременных Rh(-) принадлежности крови плодов. В МГК определение Rh-фактора плода неинвазивным методом проведено у 2 беременных с сахарным диабетом и Rh-иммунизацией определен как Rh(-), так и Rh(+)-принадлежность крови плода. Всего было проведено 6 исследований определения гомо- и гетерозиготности Rh-фактора мужей с помощью ПЦР. У 3 мужей - Rh-фактор генотипически определялся как гетерозиготный (Dd), у 3 - как гомозиготный (DD). В МГК также было проведено генотипирование Rh-фактора 2 беременным с RhD week и генотипически подтвержден Rh(+) принадлежность крови. Данное исследование Rh-фактора проведено мужчине, состоящему во втором браке, так как у его жены в первом браке были роды с Rh-иммунизацией и 2 детей с ГБН, т.е. в крови беременной Rh-антитела определялись в титре 1:32. В данном браке муж определялся изосерологически как с Rh(-)-принадлежностью крови на РСПК. Но у плода при исследовании фетальной ДНК, свободно циркулирующей в крови беременной, выявлены фрагменты ДНК 7-го экзона гена Rh-фактора, фрагментов 6-го и 10-го экзонов не обнаружено, что свидетельствует о генотипически подтвержденном Rh(+)-факторе плода. Проведено молекулярно-генетическое исследование Rh-фактора мужа, ввиду наличия ДНК обнаружена последовательность RhD(1p36.11) в гетерозиготном состоянии. Изосерологическим методом после родов ребенку определена Rh(-)-принадлежность крови, что привело к отсутствию Rh-иммунизации с плодом и новорожденным.

Заключение. Из всех вышеперечисленных молекулярно-генетических методов перспективным остается неинвазивное определение фетальной ДНК Rh-фактора плода свободно циркулирующей в крови беременной с Rh(-)-принадлежностью крови.



Значимость оценки экспрессии толерогенной молекулы CD200 на аллогенных лимфоцитах при прогнозировании эффективности иммунизации супружеских пар с невынашиванием беременности

Арефьева А.С., Николаева М.А., Степанова Е.О., Тетруашвили Н.К., Кречетова Л.В.

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация

Актуальность. Диагноз "идиопатический привычный выкидыш" (ПВ) ставится при исключении генетических, анатомических, гормональных, инфекционных и аутоиммунных этиологических факторов привычных потерь беременности и составляет до 50% от всех случаев ПВ. Основной причиной возникновения идиопатического ПВ считается нарушение формирования иммунологической толерантности матери к антигенам плода. Предгестационная иммуноцитотерапия (ИЦТ) является эффективным подходом к коррекции иммунологического фона у женщин с ПВ в анамнезе. Предполагается, что молекула CD200, активно экспрессирующаяся на поверхности лимфоцитов, способствует формированию иммунологической толерантности в результате ИЦТ. Однако для эффективной имплантации эмбриона необходимо наличие провоспалительного иммунологического фона. Мы предположили, что избыточная экспрессия CD200 на вводимых при предгестационной ИЦТ аллогенных лимфоцитах может препятствовать протеканию локального воспалительного процесса и наступлению беременности.

Цель - выявить зависимость между экспрессией CD200 на аллогенных лимфоцитах и наступлением беременности после проведения ИЦТ.

Материал и методы. В исследование были включены 37 супружеских пар с идиопатическим ПВ в анамнезе. Предгестационные аллоиммунизации проводили в середине фолликулярной фазы двух последовательных менструальных циклов (5-9-й дни цикла). Суспензию клеток лейкоцитарной фракции периферической крови мужчины в концентрации 50х106 кл/мл вводили внутрикожно в ладонную поверхность предплечья женщины (10-12 инъекций по 0,2 мл суспензии). Фенотипирование аллогенных и аутологичных лимфоцитов проводили с использованием проточной цитофлуориметрии. Мультиплексное определение концентрации цитокинов в супернатантах стимулированных культур цельной периферической крови женщин проводили с помощь проточной цитофлуориметрии и технологии FlowCytomix™.

Результаты. После ИЦТ беременность наступила у 27 (73%) пациенток. В 23 (85,2%) случаях доношенная беременность завершилась рождением живого ребенка. Наступление беременности не зависело от количества вводимых лимфоцитов, экспрессирующих молекулу CD200, однако наблюдалась строгая корреляция между наступлением беременности и уровнем экспрессии CD200 на поверхности лимфоцитов. ROC-анализ (AUC=0,755, чувствительность 62,5%, специфичность 84,6%, p=0,02) показал, что при превышении порогового уровня экспрессии CD200 (>64,6 r.u.) вероятность наступления беременности уменьшается в 4,6 раза. В группе пациентов с низким уровнем экспрессии CD200 беременность не наступила у 12% женщин, тогда как в группе с высоким уровнем CD200 беременность отсутствовала у 55,6% женщин. Была выявлена позитивная корреляция между уровнем экспрессии CD200 на поверхности вводимых лимфоцитов и содержанием регуляторных Т-клеток в периферической крови женщин, определяемых после завершения ИЦТ. Уровень экспрессии CD200 негативно коррелировал с содержанием NK-клеток в периферической крови женщин после терапии, а также с содержанием митоген-индуцированных провоспалительных цитокинов в культуре цельной периферической крови женщин: IFN-γ, TNF-α и их соотношениями с IL-4 (IFN-γ/IL-4 иTNF-α/IL-4).

Заключение. Превышение порогового уровня экспрессии молекулы CD200 на поверхности аллогенных лимфоцитов вызывает супрессию провоспалительного фона и приводит к снижению вероятности наступления беременности в течении как минимум 12 менструальных циклов.



Оценка тромбоиитарного гемостаза у недоношенных новорожденных методом проточной иитофлуориметрии

Безнощенко О.С., Маркелов М.И., Квеквескири М.Д., Киртбая А.Р., Балашова Е.Н., Ионов О.В., Дегтярев Д.Н., Кречетова Л.В., Тимофеева Л.А., Макиева М.И.

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация

E-mail: ospa-a@yandex.ru

Актуальной задачей является исследование тромбоцитарного гемостаза у новорожденных. Однако оно осложняется маленьким объемом образца крови, отсутствием стандартизации и контрольных значений для выполнения большинства функциональных тестов, а также неполным пониманием функционального фенотипа неонатальных тромбоцитов. Современный тест функциональной активности тромбоцитов (ФАТ), осуществляемый методом проточной цитофлуориметрии (ПЦ), дает полную информацию о функциональном состоянии тромбоцитов, их способности к активации в присутствии агонистов. Использование 20 мкл цельной крови без предварительной обработки дает возможность применять ФАТ для новорожденных с экстремально низкой массой тела.

Цель - сравнить тромбоцитарный гемостаз у здоровых и недоношенных новорожденных методом проточной цитофлуориметрии.

Методы. Исследовали периферическую кровь с цитратом натрия 3,2%, полученную у 35 детей 2-х суток жизни 39-40 нед гестации и 14 недоношенных новорожденных 1-х суток жизни 30-32 нед гестации, обследованных с 2017 по 2019 г. Поверхностные рецепторы и внутриклеточные гранулы тромбоцитов определяли с помощью моноклональных антител к CD61(PE), CD42b (PE), PAC1 (FITC), CD62P (Alexa647) и аннексину V (Alexa647). Общее количество антигена тромбоцитов оценивали по интенсивности флуоресценции нативных и активированных смесью АДФ активаторов тромбиновых рецепторов SFLLRN (активатор PAR1) и AYPGKF (активатор PAR4). Пробы анализировали на цитометре Gallios (Beckman Coulter, США). Оценка "прокоагулянтных" тромбоцитов осуществлялась от общего числа тромбоцитов, несущих на своей поверхности фосфа-тидилсерин (аннексин V, ФС). Данные представлены в виде медианы и доверительного интервала 95%. Значимость различий оценивали с использованием U-критерия Манна-Уитни.

Результаты. В состоянии покоя общее количество активированного гликопротеина IIbIIIa (PAC1) и гликопротеина GP-1b (CD42b) на поверхности тромбоцитов преобладало у недоношенных новорожденных (0,51, 0,42-0,57) и (12,5, 11,005-15,78) по сравнению с контрольной группой (0,71, 0,57-0,77) и (10,78, 9,88-11,62) (р<0,05). Поверхностное количество гликопротеинов IIbIIIa (PAC1) характеризует степень предактивации тромбоцитов, а GP-1b (CD42b) - способность к адгезии на поврежденном эндотелии. Количество прокоагулянтных тромбоцитов, несущих на своей поверхности ФС, интегрин β3 (CD61) и P-селектин (CD62p), не отличалось в группах сравнения. После воздействия смеси активаторов экспрессия гликопротеина IIbIIIa (CD61), характеризующего количество рецепторов для связывания фибриногена, была выше у недоношенных и составила (16,8, 14,05-18,2) и (13,3, 12,8-14,4). По остальным маркерам активации, включая секрецию гранул, группы не отличались.

Заключение. Методом ПЦ получены данные о предактивации тромбоцитов в покое и повышенной активации после стимуляции. Кроме того, у недоношенных детей отмечается повышенная адгезивная способность тромбоцитов.



Высокий уровень D-димера прогнозирует геморрагические осложнения у недоношенных новорожденных

Безнощенко О.С., Шпилюк М.А., Квеквескири М.Д., Киртбая А.Р., Балашова Е.Н., Ионов О.В., Дегтярев Д.Н., Кречетова Л.В.

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация

Актуальность. D-димер позволяет в комплексе оценить коагуляцию (свертывание крови) и фибринолиз (растворение сгустков). Уровень D-димера прямо пропорционален степени интенсивности фибринолиза. Несмотря на то что у новорожденных фибринолиз снижен, в крови обнаруживаются более высокие концентрации продуктов деградации фибрина по сравнению со взрослыми. Система гемостаза у новорожденных имеет существенные отличия от системы взрослых и даже детей 1-го года жизни.

Цель - определить предиктор кровотечения у недоношенных новорожденных по данным коагулометрических тестов.

Методы. В исследование включены 38 недоношенных детей (34,5+0,7 нед гестации), обследованных с 2017 по 2019 г. В периферической крови (с цитратом натрия 3,2%) новорожденных 1-х суток жизни оценивали параметры плазменного гемостаза: фибриноген, протромбин по Квику, АЧТВ, протеин С и антитромбин III, D-димер. Исследования проводили на автоматическом коагулометре ACL TOP 700 (IL Werfen, США) с использованием реагентов HemosIL. Данные представлены в виде медианы (Me) и доверительного интервала 95%. Значимость различий оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни. Диагностическую значимость параметров оценивали с использованием ROC-анализа.

Результаты. На основании ретроспективного анализа динамики состояния дети были разделены на 2 группы: 1-я группа - недоношенные без признаков кровотечения (n=23), 2-я группа - новорожденные с проявлениями геморрагического синдрома (внутрижелудочковое кровотечение II-III степени, желудочное и/или легочное кровотечения) (n=15). Во 2-й группе уровень D-димера в плазме крови был существенно выше (3098, 113-38866) мкг/л, чем в группе сравнения (920, 314-9999) мкг/л, p=0,022. Проведенный ROC-анализ позволил выявить пороговое значение D-димера (1421 мкг/л), при котором с чувствительностью 80,0% и специфичностью 73,9% можно прогнозировать развитие кровотечения (AUC = 0,72, р=0,014).

Заключение. Уровень D-димера, превышающий 1421 мкг/л, может служить предиктором кровотечений у недоношенных новорожденных.



Иммуногистохимические маркеры в диагностике патологии эндометрия

Волкова Л.В.

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта", Клинико-диагностический центр, 236016, г. Калининград, Российская Федерация

В последние годы для диагностики патологии эндометрия как причины бесплодия и раннего невынашивания беременности применяется комплексный подход, включающий гистологические и иммуногистохимические (ИГХ) исследования, прежде всего направленный на верификацию хронического эндометрита и эндокринопатий. Описаны различные панели ИГХ-маркеров, включающие антитела к ER и PR, к субпопуляциям лимфоцитов и структурам эндометрия - CD3, CD4, CD8, CD10, CD20, CD56, CD68, CD79a, CD138, CD163, LIF и некоторые другие.

Цель исследования - анализ опыта применения ИГХ-метода для диагностики хронического эндометрита и рецепторного статуса эндометрия при бесплодии и раннем невынашивании беременности.

Материал и методы. Исследование эндометрия пациенток с бесплодием и ранним невынашиванием беременности при подготовке к экстракорпоральному оплодотворению (ЭКО) по материалу биопсий эндометрия, преимущественно пайпель-биоптатов, проводилось с 2014 по 2020 г. в Калининграде (Volkova L.V., 2017-2019). Гистологическое исследование выполняли в комплексе с ИГХ-окрашиванием на иммуногистостейнере Bond Max с использованием антител (АТ) к рецепторам эстрогенов (6F11) и прогестерона (16), маркеров CD3 (LN 10), CD 79a (11E3), Ki67 (Clone MIB 1, Dako), CD4, CD8, CD20, CD138, Multi-Cytokeratin, Р53. При оценке результатов описывали локализацию и количество позитивно окрашенных структур и клеточных элементов, при оценке рецепторного статуса эндометрия применяли метод H-Score.

Результаты. Многолетние исследования ограниченного объема материала пайпель-биоптатов у пациенток с бесплодием и ранним невынашиванием беременности при подготовке к ЭКО, подозрении на хронический эндометрит продемонстрировали:

особую важность стандартизации исследования на преаналитическом и аналитическом этапах: фиксация, выбор ИГХ-маркеров, подбор реагентов и аппаратная процедура ИГХ-окрашивания на иммуногистостейнере;

необходимость стандартизации методики учета реакции и опыта исследования небольшого объема материала эндометрия, зачастую значительно фрагментированного, врачом-морфологом;

исследование экспрессии рецепторов эндометрия предпочтительно на одинаковых (или сходных по структуре) тканевых фрагментах с использованием метода H-Score и обязательным учетом вероятных артефактов при исследовании малых образцов;

необходимость доступности представления/интерпретации результатов комплексного гистологического и ИГХ-исследования.

Заключение. Результаты исследования свидетельствуют о том, что эффективными показателями при ИГХ-исследовании патологии эндометрия на материале пайпель-биоптатов являются: 1) оценка CD3+-Т-клеток (наличие и выраженность диффузной/очаговой инфильтрации, локализация инфильтратов в эндометрии); 2) наличие мелких фокусов фиброза объективно диагностируется даже на небольших фрагментах ткани; 3) при верификации хронического эндометрита в малых образцах с использованием маркеров В-лимфоцитов и плазматических клеток следует учитывать их небольшое количество и гетерогенность локализации в эндометрии, а также вероятные артефакты при выявлении единичных клеток, что не всегда позволяет использовать этот показатель как объективный критерий воспалительного процесса; 4) при оценке рецепторного статуса объективным показателем является прогестерон-эстрогеновый индекс в строме и железистом компоненте эндометрия.



Способ прогнозирования роста миоматозного узла у пациенток с лейомиомой матки

Воскресенская Д.Л., Воронин Д.Н., Малышкина А.И., Сотникова Н.Ю.

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 153045, г. Иваново, Российская Федерация

The method for predicting the growth of the myomatous node in patients with uterine leiomyoma

Daria L. Voskresenskaya, Dmitry N. Voronin, Anna I. Malyshkina, Natalia Yu. Sotnikova

Federal State Budget Institute Ivanovo Scientific-Research Institute named after V.N. Gorodkov, 153045, Ivanovo, Russian Federation

E-mail: kasyanikdariakis@mail.ru

Актуальность. Лейомиома матки - доброкачественная гормонально-зависимая опухоль, развивающаяся в миометрии в результате гипертрофии и пролиферации элементов мышечной и соединительной ткани. На протяжении длительного времени заболевание стоит на 2-м месте в общей структуре гинекологической патологии. В последнее время появилась и неуклонно усиливается тенденция к повышению частоты встречаемости данной опухоли у пациенток молодого возраста, еще не реализовавших свою репродуктивную функцию [1]. Исследования последних лет продемонстрировали непосредственное участие иммунных механизмов в развитии и росте данной доброкачественной опухоли. Установлено, что в эндометрии, непосредственно соприкасающемся с тканью миомы, происходит усиленная инфильтрация макрофагов с фенотипом альтернативной активации, которые влияют на рост узла [2]. Рост миоматозного узла влечет за собой появление или усиление симптомов заболевания, снижает репродуктивный потенциал пациентки, ухудшая качество жизни женщины. Поэтому для успешного органосохраняющего лечения лейомиомы матки необходимо разрабатывать малоинвазивные лабораторные способы, позволяющие еще на ранней стадии выявления заболевания и в оптимально короткие сроки выбрать адекватную тактику ведения пациенток, направленную на предотвращение прогрессирования опухолевого роста, принимая во внимание репродуктивные планы женщины.

Цель исследования - разработать прогностические критерии роста лейомиомы матки по содержанию альтернативно активированных макрофагов в эндометрии, локализованном в проекции миоматозного узла.

Материал и методы. Обследованы 19 женщин 29-38 лет с симптомной лейомиомой матки. Материалом для исследования служили биоптаты эндометрия, расположенного в проекции миоматозного узла, полученные в ходе выполнения гистероскопии. Выделение популяции мононуклеарных клеток из эндометрия проводили стандартным безферментативным методом с последующим центрифугированием в градиенте плотности фиколлурографина. Уровень CD36+- и CD204+-макрофагов оценивали с помощью моноклональных антител методом проточной цитометрии в макрофагальном гейте. Для оценки прогностической и диагностической значимости исследуемых показателей применялся ROC-анализ.

Результаты. Проведенное ретроспективное исследование позволило выявить пороговые показатели содержания макрофагов в эндометрии пациенток с лейомиомой матки. Так, при значении CD36+-макрофагов <22% и CD204+-макрофагов <20% прогнозируется увеличение размеров лейомиомы матки в течение 1 года наблюдения. Показано, что альтернативно активированные макрофаги, присутствующие в опухоли, могут участвовать в одном из механизмов увеличения размера узла: в продукции компонентов внеклеточного матрикса [3]. Полученный прогностический параметр относительного содержания в мононуклеарных клетках эндометрия, расположенного в проекции миоматозного узла, CD36+- и CD204+-макрофагов позволяет с высокой точностью (89,5 и 84,2% соответственно) уже при первой постановке диагноза прогнозировать рост миоматозного узла, что позволяет в оптимальные сроки выбрать необходимую тактику ведения пациентки.

Литература

1. Тоноян Н.М. и др. Рецидивы миомы матки. Современный взгляд на проблемы диагностики, лечения и прогнозирования // Акушерство и гинекология. 2019. № 3. С. 32-38.

2. Kitaya K., Yasuo T. Leukocyte density and composition in human cycling endometrium with uterine fibroids // Hum Immunol. 2010. Vol. 71 (2). P. 158-163.

3. Protic O. et al. Possible involvement of inflammatory/reparative processes in the development of uterine fibroids // Cell and Tissue Research. 2016. Vol. 364. P. 415-427.



Концентрация васкулоэндотелиального фактора роста в эякуляте здоровых и инфертильных мужчин

Галькович К.Р. 1, Соснин Д.Ю. 2

1 Общество с ограниченной ответственностью "Медгарант", 614000, г. Пермь, Российская Федерация

2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 614990, г. Пермь, Российская Федерация

Актуальность. Среди причин бесплодных браков существенная роль принадлежит мужскому фактору, при котором регистрируется снижение фертильности эякулята. Состав семенной плазмы значительно влияет на плодовитость спермы. Одним из белковых компонентов эякулята является васкулоэндотелиальный фактор роста (ВЭФР, англ. VEGF). Данный протеин продуцируется различными типами клеток (макрофаги, эндотелиоциты, гладкомышечные клетки и др.), активно участвует в процессах васкулогенеза - образования сосудистой системы в эмбриональном периоде и ангиогенеза - формирования новых сосудов при уже существующей сосудистой сети.

Цель настоящего исследования - изучение содержания васкулоэндотелиального фактора роста в сыворотке крови и семенной плазме в норме и при мужском бесплодии.

Материал и методы. В исследование были включены 64 мужчины в возрасте от 24 до 52 лет. Основную группу (1-я группа) составили 16 пациентов с азооспермией. Группа сравнения (2-я группа) включала 24 пациента с олигозооастеноспермией. Контрольная группа (3-я группа) была представлена 24 здоровыми мужчинами с нормальными параметрами эякулята. Концентрацию ВЭФР определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора реактивов "VEGF - ИФА - БЕСТ" (А 8784) (ЗАО "Вектор-Бест", Россия).

Результаты. Средняя концентрация в образцах неразведенной семенной плазмы составила 3346±129,6 пг/мл (медиана - 3361, интерквартильный диапазон - 3250; 3461,5 пг/мл). В сыворотке крови содержание ВЭФР было в 16,24 раза ниже и составило 206±99,1 пг/мл (медиана - 194, интерквартильный диапазон - 112,5; 295,5 пг/мл) (р=0,000000). В семенной плазме обнаружены статистически значимые различия между группами (р=0,0076). При попарном сравнении исследованных групп различия обнаружены только при сравнении с контрольной группой (p3-1=0,030146; p3-2=0,018849). Для сыворотки крови статистически значимые различия отсутствовали между всеми группами (р=0,1263). При оценке корреляционных связей между уровнем ВЭФР в сыворотке крови и семенной плазме статистически значимой связи не выявлено. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена для всех результатов исследования составил R= -0,027869 (p=0,826959).

Заключение. Семенная плазма мужчин характеризуется необычно высоким содержанием ВЭФР, более чем в 10 раз превосходящим концентрацию этого белка в сыворотке: данный факт свидетельствует об активной продукции ВЭФР в семенную плазму добавочными половыми железами мужчины, а не пассивным проникновением из крови в результате диффузии по градиенту концентрации. Снижение содержания ВЭФР в семенной плазме пациентов с азооспермией и олигозооастеноспермией, вероятно, обусловлено заболеваниями органов мужского урогенитального тракта. К возможным функциям ВЭФР могут относиться стимуляция пролиферации клеток слизистой эндометрия и их подготовка к предстоящей имплантации яйцеклетки после оплодотворения. Необходимо проведение дальнейших исследований для изучения роли ВЭФР в процессах репродукции в мужском и женском организмах.



Классическая галактоземия в Свердловской области: итоги неонатального скрининга

Дерябина С.С.1, 2, Лагутина О.В.1, Беляева Т.И.1, Никитина Н.В.1, Ворошнин В.В.1, Николаева Е.Б.1

1 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Свердловской области "Клинико-диагностический центр “Охрана здоровья матери и ребенка”", 620041, г. Екатеринбург, Российская Федерация

2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина", 620002, г. Екатеринбург, Российская Федерация

Актуальность. Галактоземия - одно из 5 наследственных заболеваний обмена, входящих в государственную Программу неонатального скрининга Российской Федерации, ранняя диагностика которого позволяет выявлять больных младенцев на доклинической стадии заболевания, своевременно назначать соответствующее лечение и тем самым контролировать показатели инвалидизации и смертности населения от данной патологии.

Цель исследования - проанализировать данные, полученные в результате неонатального скрининга на классическую галактоземию в Свердловской области за весь период действия расширенной программы массового обследования новорожденных в РФ.

Материал и методы. Обследованы 698 550 детей, рожденных на территории Свердловской области с 2006 по 2019 г. Первоначально в сухом пятне крови определяли уровень общей галактозы и галактозо-1-фосфата, для молекулярно-генетического подтверждения диагноза образцы направляли в Медико-генетический научный центр (г. Москва). С 2010 г. биохимическим маркером галактоземии выбрана активность фермента галактозо-фосфат-уридил-трансферазы (GALT), верификация диагноза методами ПДРФ и секвенирования по Сэнгеру проводится в лаборатории молекулярной диагностики КДЦ "Охрана здоровья матери и ребенка".

Результаты. Количество детей, вошедших в группу риска по результатам 2-этапного исследования сухого пятна крови и направленных на молекулярно-генетическое исследование, составило 657 человек. При этом у 134 детей снижение активности фермента GALT было вызвано не генетическими причинами (отсутствие в образцах ДНК измененных вариантов в гене GALT). У 20% обследованных (142 ребенка) обнаружен вариант галактоземии Дуарте [наличие гетерозиготного носительства одного патогенного аллеля GALT и варианта N314D (Дуарте)]. Диагноз "классическая галактоземия I типа" подтвержден у 8 новорожденных. 1 ребенок умер, 7 наблюдаются в отделении медико-генетического консультирования КДЦ "ОЗМР".

Частота встречаемости данного заболевания на территории Свердловской области за все время проведения скрининга составила 1:87 318 живорожденных.

Спектр выявленной патологии в гене GALT: K285N (31,3%), Q188R (25,0%), M142K (12,5%), E352Q (12,5%), W316X (6,2%), R262W (6,2%), P140L (6,2%). Вариант - NM_000155.4(GALT): с.419С>T (p.Pro140Leu) - новый, ранее не описанный. Использование предсказательных программ патогенности (PolyPhen2.0, Mutation Taster) позволяет рассматривать данную замену вероятно патогенной.

Для родителей и сибсов больных детей выполнены молекулярно-генетические исследования по выявлению внутрисемейного наследования моногенной патологии. Для одной семьи проведена пренатальная диагностика, установлено гетерозиготное носительство мутации E352Q у плода, родился здоровый ребенок.

Заключение. Неонатальный скрининг на основе определения активности фермента GALT позволяет выявлять гетерозиготных носителей патогенных мутаций, однако маловероятно, что величина распространенности классической галактоземии I типа в уральской популяции претерпит существенные изменения при дальнейшем увеличении срока скринирования на данное заболевание.



Цервикальная интраэпителиальная неоплазия - цель региональной программы скрининга рака шейки матки

Димитриади Т.А.1, 2, Бурцев Д.В.1, 2, Дженкова Е.А.3, Холодная Т.О.1, 2

1 Государственное автономное учреждение Ростовской области Областной консультативнодиагностический центр, 344000, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация

2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ростовский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 344022, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация

3 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 344037, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация

E-maiL: tdimitriadi@yandex.ru

Актуальность. По данным Международного агентства по исследованию рака (GLOBOCAN, IARC), в 2017 г. в мире 570 тыс. случаев рака у женщин и 60 тыс. случаев рака у мужчин были связаны с вирусами папилломы человека (ВПЧ), что соответствует 8,6 и 0,8% от всех случаев рака во всем мире. Ежегодно в мире регистрируется порядка 530 тыс. случаев рака шейки матки (РШМ) (4-й по частоте встречаемости вид рака среди женщин), расчетное число смертей от РШМ за год - 266 тыс. (также 4-е место среди злокачественных новообразований, повлекших за собой смерть). Во многих странах Европы, США, Австралии и Новой Зеландии заболеваемость РШМ снизилась, что связано с повышением уровня жизни населения, а в некоторых странах - с внедрением эффективной системы вторичной профилактики в течение последних 30 лет.

Цель - оценить работу эффективность применения методов жидкостной цитологии и ВПЧ тестирования в региональной программе скрининга РШМ в Ростовской области (РО) за 2016-2019 гг.

Материал и методы. 54 медицинские организации РО (35% всех медицинских организация РО) включены, согласно приказу Министерства здравоохранения РО № 1375 от 13.09.2012, в региональную скрининговую программу, согласно которой пациенткам по месту жительства проводится забор мазков с шейки матки, биоматериал централизовано курьерской службой доставляется в лабораторию Областного консультативно диагностического центра, где выполняется цитологическое исследование. Второй этап диагностики - определение в клеточном материале вирусов папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска. ВПЧ-позитивные пациентки с патологическими цитологическими мазками приглашаются в Областной центр патологии шейки матки (ОЦПШМ) для диагностики и лечения.

Результаты. С 2016 по 2019 г. выполнено 188 641 цитологическое исследование, РШМ был выявлен у 189 женщин - 0,1%, плоскоклеточные интраэпителиальные поражения высокого риска (H-SIL) - у 0,3%, атипические клетки неясного значения (ASCUS) - у 0,2%, плоскоклеточные интраэпителиальные поражения низкого риска (L-SIL) - у 12,2%, отсутствие внутриклеточного поражения или злокачественности (NILM) - у 87,2%. Выявлено несоответствие степени повреждений, определяемых цитологически и гистологически: при CIN1 гипердиагностика до H-SIL наблюдалась у 32%, гиподиагностика CIN 2 до L-SIL зафиксирована у 18% больных. Соответствие цитологической и гистологической оценки повреждений выявлено при CIN1 у 62%, при CIN2 - у 75%, при CIN3 - у 89%, при CIS - 88% случаев.

Заключение. Совместное использование диагностических методов - жидкостной цитологии и ВПЧ-тестирования позволяет выявлять предраковые поражения эпителия шейки матки и РШМ с высокой гистологической воспроизводимостью диагноза. Чувствительность цитологического метода растет по мере увеличения степени неоплазии.



Использование иммуногистохимического исследования в диагностике цервикальной интраэпитеальной неоплазии

Димитриади Т.А.1, 2, Бурцев Д.В.1, 2, Дженкова Е.А.3, Холодная Т.О.1, 2, Двадненко К.В.1, 2

1 Государственное автономное учреждение Ростовской области Областной консультативно-диагностический центр, 344000, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация

2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ростовский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 344022, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация

3 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 344037, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация

E-mail: tdimitriadi@yandex.ru

Актуальность. Рак шейки матки (РШМ) - широко распространенная в мире патология: ежегодная заболеваемость составляет 13,2 случаев на 100 тыс. женщин, а ежегодная смертность - 5,9 случаев на 100 тыс. женщин в год. К заболеваниям шейки матки, предшествующим инвазивному РШМ, относят дисплазии эпителия или цервикальные интраэпителиальные неоплазии (CIN). Концепция канцерогенеза предполагает последовательную прогрессию от CIN1 до CIN2 и CIN, cancer in situ (CIS) и развития инвазивного рака на фоне персистирующей ВПЧ-инфекции высокого канцерогенного риска.

Цель - оценить иммуногистохимические профили различных стадий диспластической трансформации шейки матки.

Материал и методы. Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) по оценке экспрессии маркеров P16 INK4a , Cyclin D1, Ki-67. 56 депарафинированных срезов с блоков тканей шейки матки, полученных от препаратов петлевой эксцизии (конизации) зоны трансформации. В качестве контроля использован 31 образец ткани шейки матки больных с ВПЧ-инфекцией, но не имеющих CIN CIS

Результаты. Получены следующие уровни экспрессии биомаркеров для CIN1: Ki-67 в покровный эпителии 11-20%, в железах - 7-13%, P16 INK4a в покровном эпителии 4-8%, Cyclin D1 в покровном эпителии и железах 10-11%; для CIN 2 Ki-67 в покровный эпителии 55-75%, в железах 73-91% P16 INK4a в покровном эпителии 50-60%, в железах 80-95%, Cyclin D1 в покровном эпителии и железах 8-9%; для CIN 3 Ki-67 в покровный эпителии 85-95%, в железах 92-95%, P16 INK4a в покровном эпителии 70-80%, в железах 96-98%, Cyclin D1 в покровном эпителии и железах 5-6%; для CIS Ki-67 в покровный эпителии 96-100%, в железах 96-100%, P16 INK4a в покровном эпителии 96-100%, в железах 96-100% , Cyclin D1 в покровном эпителии и железах 3-4%

Заключение. Иммуногистохимическое исследование с определением экспрессии маркеров P16 INK4a, Cyclin D1, Ki-67 в диспластических клетках обеспечивает прогностическими признаками клеточной пролиферации с неблагоприятным прогнозом еще на стадии ранних клеточных изменений, когда кольпоскопия, цитологическое и гистологическое исследование недостаточно эффективны, позволяет уточнять диагностику степени дисплазии шейки матки.



Биологические особенности штаммов Enterococcus Faecalis, выделенных из мочи у новорожденных с инфекцией мочевыводящих путей в Приморском крае

Зайцева Е.А.1, Коменкова Т.С.1, Мельникова Е.А.2, Вайсеро Н.С.3

1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Тихоокеанский государственный медицинский университет" Минздрава России, 690002, г. Владивосток, Российская Федерация

2 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения "Краевая детская клиническая больница № 1", 690078, г. Владивосток, Российская Федерация

3 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения "Приморская краевая клиническая больница № 1", 690091, г. Владивосток, Российская Федерация

Biological features of the Enterococcus Faecalis strains isolated from urine in newborn with urinary infections in the Primorsky Krai

Zaitseva E.A.1, Komenkova T.S.1, Melnikova E.A.2, Vaisero N.S.3

Инфекция мочевыводящих путей (ИМВП) - актуальная проблема современной педиатрии: она занимает 2-3-е место в структуре детской заболеваемости. Важную роль в этиологии ИМВП наряду с грамотрицательными бактериями семейства Enterobacteriales играют грамположительные Enterococcus faecalis, имеющие первостепенное значение в развитии ИМВП у новорожденных в Приморском крае. Среди многочисленных факторов, влияющих на развитие ИМВП и ее прогноз, большое значение имеют микробиологические свойства микроорганизмов, колонизирующих почечную ткань. Известно, что количество детектируемых генов факторов патогенности коррелирует с вирулентностью штаммов.

Цель - оценить микробиологические свойства E. faecalis, выделенных из мочи новорожденных с инфекцией мочевыводящих путей в Приморском крае, для оценки их вирулентного потенциала.

Материал и методы. В работе исследованы штаммы E. faecalis (n=12), изолированные из мочи новорожденных с ИМВП в Приморском крае в 2013-2016 гг.

Чувствительность энтерококков к антимикробным препаратам определяли диско-диффузионным методом на среде Мюллера-Хинтон (BioMerieux, Франция). Тестирование генов патогенности (aggA, esp, efaA, eep, cylA, gelE) и антибиотикорезистентности [aac (6’)-Ie-aph (2’’)-Ia, ant (6’)-Ia, tetM tetL и ermB] проводили с помощью полимеразной цепной реакции на амплификаторе "TProfessional 96" (Biometra, Германия). Детекцию продуктов амплификации осуществляли в 1% агарозном геле с помощью гель-документирующей системы BioDocAnalyze (Biometra, Германия). Генотипирование изолятов проводили методом мультилокусного сиквенс-типирования (MLST).

Результаты. 6 штаммов E. faecalis, изолированных из мочи новорожденных, показали устойчивость к фторхинолонам (ципрофлоксацину, левофлоксацину и норфлоксацину). 8 изолятов были резистентны к аминогликозидам (гентамицину, стрептомицину).

Уропатогенные E. faecalis характеризовались наличием от ≥3 генов патогенности. При этом у всех исследуемых штаммов были выявлены гены efaA (белок, связанный с адгезией) и eep (усилитель экспрессии феромона). У 11 штаммов отсутствовал ген cylA (цитолизин). Больше всего у E. faecalis встречались гены, участвующие в адгезии и колонизации - esp (10/12), aggA (8/12), разрушении межклеточного вещества gelE (9/12). Наиболее часто у исследуемых штаммов E. faecalis встречались сочетания генов efaA, eep, aggA, esp, gelE (4/12).

По результатам MLST изоляты E. faecalis, выделенные из мочи новорожденных, распределились на 6 сиквенс-типов (ST6, ST21, ST25, ST40, ST179, ST774). Чаще всех среди уропатогенных E. faecalis детектировался ST774 (5/12). Штаммы E. faecalis, принадлежащие к этому сиквенс-типу, характеризовались устойчивостью к 4 группам антимикробных препаратов (фторхинолонам, гентамицину, тетрациклинам и эритромицину) и наличием 3 генов патогенности (aggA, efaA и eep).

Заключение. В последние годы в Приморском крае у новорожденных фекальный энтерококк становится основным возбудителем инфекций мочевой системы. Уропатогенные E. faecalis, выделенные из мочи новорожденных с ИМВП, обладают различными профилями резистентности и патогенности. Полученные результаты открывают перспективу дальнейших исследований в этом направлении.



Исследование репертуара плацента-ассоциированных антигликановых антител как основа для разработки иммуноглобулинового препарата для профилактики и лечения преэклампсии

Зиганшина М.М.1, Шилова Н.В.1, 2, Терентьева А.В.3, Хасбиуллина Н.Р.1, 4, Долгополова Е.Л.1, Нокель А.Ю.1, Обухова П.С.1, 2, Шмаков Р.Г.1, Бовин Н.В.2

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация

2 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, 117997, г. Москва, Российская Федерация

3 Федеральное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), 119991, г. Москва, Российская Федерация

4 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органической химии имени Н.Д. Зелинского Российской академии наук, 119991, г. Москва, Российская Федерация

Research of the repertoire of placenta-associated anti-glycan antibodies as basis for the development of an immunoglobulin preparation for the prevention and treatment of preeclampsia

Marina M. Ziganshina1, Nadezhda V. Shilova1, 2, Anna V. Terentyeva3, Nailya R. Khasbiullina1, 4, Elena L. Dolgopolova1, Alexey Yu. Nokel1, Polina S. Obukhova1, 2, Roman G. Shmakov1, Nikolay V. Bovin2

1 Kulakov Obstetrics, Gynecology and Perinatology National Medical Research Center of Ministry of Healthcare of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation

2 Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemestry of the Russian Academy of Sciences, 117997, Moscow, Russian Federation

3 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of Ministry of Healthcare of the Russian Federation (Sechenov University), 119991, Moscow, Russian Federation

4 N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry Russian Academy of Sciences, 119991, Moscow, Russian Federation

Патология плаценты играет определяющую роль в развитии преэклампсии (ПЭ). Установлено, что при ПЭ выявляются изменения углеводного фенотипа (состава гликанов, образующих гликокаликс, ассоциированный с мембраной клетки) в структурах плаценты, которые входят в состав плацентарного барьера. Гликаны гликокаликса плаценты могут распознаваться иммунной системой матери как "образы опасности" и активировать ее. Предполагается, что при нормальной беременности (НБ) "образы опасности" маскируются антителами, которые выполняют блокирующую функцию и предотвращают развитие эффекторных реакций отторжения. При осложненной беременности количество таких антител снижено. В настоящее время мишени плацента-ассоциированных антител (ПА-АТ) неизвестны, а также отсутствуют данные о содержании антител аналогичной специфичности в крови как при НБ, так и при ПЭ.

Цели исследования - выделение ПА-АТ из ткани плаценты и определение их углеводной специфичности, а также выявление частоты встречаемости этих антител в периферической крови пациенток с НБ и ПЭ.

Материал и методы. В рамках одномоментного исследования, включающего 15 пациенток с НБ и 14 пациенток с ПЭ, осуществлялся забор ткани плаценты и периферической крови при оперативном родоразрешении с последующим выделением ПА-АТ последовательной элюцией кислым и щелочным буферными растворами и дальнейшим анализом ПА-АТ и антител периферической крови на гликочипах, содержащих 400 гликанов. Одновременно детектировались антитела классов IgM и IgG.

Результаты. Установлено, что с плаценты элюируются только антитела класса G. У пациенток с НБ репертуар ПА-АТ был широким. Мишенями ПА-АТ были аминокислотные производные лактозы, Gal-терминированные структуры, GlcNAcβ-, Galα-терминированные гликаны, олиголактозамины и олигоизолактозамины, дисахарид Форссмана, дисахариды с коровыми и терминальными a и pGalNAc, а также группоспецифический антиген системы Льюис - LeA. При этом было выявлено, что ряд антител не встречается в крови либо встречается редко.

При ПЭ репертуар ПА-АТ гораздо уже. В профиле преобладают GlcNAcβ- и Galα-терминированные структуры. Лишь немногие из них не встречаются в крови. Среди них β-нейраминовая кислота и два неприродных олигосахарида, которые можно отнести к "образам опасности", однако эти антитела встречаются также в элюатах плацент при НБ. Межгрупповое сравнение показало значимо сниженный уровень ПА-АТ при ПЭ (р<0,0003).

Заключение. Идентифицирован спектр ПА-АТ с установленной углеводной специфичностью, содержание которых снижено при ПЭ. Полученные результаты могут явиться основой для разработки иммуноглобулинового препарата для восполнения антител с блокирующими свойствами при ПЭ.

Работа поддержана грантом РФФИ № 19-015-00102А.



Распространенность и типовое разнообразие ВПЧ в зависимости от пола и возраста

Зыкова Т.А., Никитина В.П., Женило О.Е., Вереникина Е.В., Иванова В.А., Крузе П.А., Меньшенина А.П., Никитин И.С., Шевченко А.Н., Хомутенко И.А., Филатова Е.В., Шевякова Е.А., Великородная Л.А.

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 344037, г. Ростов-на-Дону, Российская Федерация

Prevalence and genotype distribution of HPV depending on gender and age

T.A. Zykova, V.P. Nikitina, O.E. Zhenilo, E.V. Verenikina, V.A. Ivanova, P.A. Kruze, A.P. Men'shenina, I.S. Nikitin, A.N. Shevchenko, I.A. Khomutenko, E.V. Filatova, E.A. Shevyakova, L.A. Velikorodnaya

Rostov Research Institute of Oncology, 344037, Rostov-on-Don, Russian Federation

E-mail: tatiana2904@yandex.ru

Анализ типовой структуры возрастных, половых и территориальных закономерностей распространения вируса папилломы человека (ВПЧ) представляет интерес, так как позволяет дать оценку потенциального воздействия современных методов иммунопрофилактики.

Цель - провести анализ частоты распространенности и типовой принадлежности ВПЧ в зависимости от пола и возраста.

Материал и методы. Обследованы 424 пациента, обратившихся за медицинской помощью в ФГБУ "РНИОИ" МЗ РФ (334 женщины и 90 мужчин). Возрастная структура: до 45 лет 228 женщин и 46 мужчин, старше 46 лет - 106 и 44 соответственно. Исследовали мазки из влагалища и цервикального канала у женщин, мазки из уретры у мужчин. Экстракцию ДНК проводили сорбентным методом, амплификацию и детекцию ДНК - методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Результаты. ДНК ВПЧ обнаружена у 150 (35,4%) больных, в том числе у 115 (34,4%) женщин и 35 (38,9%) мужчин (p>0,05). У женщин наблюдалась тенденция к снижению частоты выявления ВПЧ с возрастом, а у мужчин, напротив, к росту. Так, среди женщин до 45 лет ДНК ВПЧ была обнаружена у 85 (37,3%), а после 46 лет - у 30 (28,3%, p=0,068). У мужчин эти показатели составили 14 (30,9%) и 21 (47,7%, p=0,071) соответственно.

Несколько типов вируса у молодых больных обнаруживались чаще, чем в старшей возрастной группе: у 26 (26,3%) от числа ВПЧ-позитивных в первом и у 5 (9,8%, p=0,013) во втором случае. Данное положение оказалось справедливо лишь для мужчин, у женщин мы обнаружили только тенденцию к снижению микс-инфицирования с возрастом: среди молодых женщин несколько типов вируса выявлено у 20 (23,5%), в старшей группе у 3 (10,0%, p=0,088), среди мужчин - у 6 (42,9%) и 2 (9,5%, p=0,030) соответственно.

В общей группе обследованных лиц самыми распространенными были 16-й (46,7%), 52-й (16,0%), 56-й (12,7%), 31-й (10,7%) и 18-й (10,0%) типы ВПЧ; 16-й тип ВПЧ доминировал как у женщин - 50 (50,4%), так и у мужчин - 12 (34,3%). В распределении последующих ранговых мест у женщин за 16-м типом следовали 31-й - 13 (11,3%) и 52-й - 13 (11,3%), далее 18-й - 12 (10,4%) и 56-й - 11 (9,6%) типы; у мужчин 52-й - 11 (31,4%), 56-й - 8 (22,9%), 45-й - 4 (11,4%) и 18-й - 3 (8,6%) типы ВПЧ. Отметим, что 51-й тип вируса был определен только у женщин (8,7%). Суммарный удельный вес двух типов ВПЧ, обладающих наибольшим онкогенным потенциалом (16-й и 18-й), в общей когорте больных составил 85 (56,7% числа ВПЧ-позитивных); среди женщин он был выше, чем у мужчин, и составил 70 (60,9%) и 15 (42,9%, p=0,046) соответственно. У женщин сочетание инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), и ВПЧ регистрировались чаще, чем у мужчин (24,3 vs 13,2%; p=0,024).

Заключение. В ходе проведенного исследования в изучаемой когорте больных не обнаружено статистически значимого отличия частоты общего показателя распространенности ВПЧ среди женщин и мужчин. В то же время мы установили некоторые различия по ряду частных показателей в зависимости от пола и возраста: если у женщин наблюдали тенденцию к снижению частоты выявления ВПЧ с возрастом, то у мужчин, напротив, к росту. Одновременное инфицирование несколькими типами ВПЧ статистически значимо чаще определялось у молодых больных по сравнению со старшей возрастной группой в общей когорте и у мужчин. При доминировании 16-го типа ВПЧ распределение последующих ранговых мест у женщин и мужчин отличалось. Суммарная частота распространенности 16-го и 18-го типов статистически значимо превышала этот показатель у женщин по сравнению с мужчинами. Сочетанное инфицирование возбудителями ИППП и ВПЧ у женщин регистрировалось чаще, чем у мужчин.



Терапевтический лекарственный мониторинг как инструмент повышения эффективности и безопасности антибактериальной терапии при беременности

Ивжиц М.А.1, 2, Ченкуров М.С.1, 2, Зырянов С.К.1, 2, Бондарева И.Б.2, Казанова А.М.2

1 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения "Городская клиническая больница № 24" Департамента здравоохранения г. Москвы, 127015, г. Москва, Российская Федерация

2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов", 117198, г. Москва, Российская Федерация

Therapeutic drug monitoring as a tool to increase the effectiveness and safety of antibiotic therapy during pregnancy

M.A. Ivzhits1,2, M.S. Chenkurov1,2, S.K. Zyryanov1,2, I.B. Bondareva2, A.M. Kazanova2

Актуальность. Терапевтический лекарственный мониторинг (ТЛМ) - это клиническая практика измерения конкретных лекарственных средств через определенные интервалы времени для поддержания постоянной концентрации в кровотоке пациента, что позволяет оптимизировать индивидуальные режимы дозирования [1]. Рутинный ТЛМ позволяет проводить рациональную, специфичную для пациента коррекцию дозы, повышая эффективность лечения с минимизацией токсичности [2], однако в случае терапии β-лактамами, которые обладают превосходным профилем безопасности, основной целью для проведения ТЛМ является максимизация бактерицидного действия [3]. Применение ТЛМ показано пациентам с выраженной фармакокинетической вариабельностью, к ним относятся и беременные [4, 5]. Для обеспечения адекватной терапии при разработке режимов дозирования решается одна из основных проблем - защита от инфекций с учетом физиологических изменений, возникающих на фоне беременности [6].

Цель - оценить эффективность и безопасность фармакотерапии меропенемом на фоне беременности (срок - 34 нед) при остром гангренозном аппендиците в связи с изменением объема распределения (Vd) во время беременности.

Материал и методы. Разовая доза меропенема составляла 2 г, суточная - 6 г. Режим дозирования каждые 8 ч продленной инфузией в течение 1 ч. Плазменные концентрации определяли методом высокоэффективной жидкостной эффективной хроматографии (ВЭЖХ). Был осуществлен забор крови на 2-й и 3-й дни терапии для определения плазменных концентраций меропенема в течение 5 мин до начала инфузии и в течение 5 мин после окончания инфузии меропенема с последующей пробоподготовкой по принятой методике.

Результаты. Проведен терапевтический лекарственный мониторинг методом ВЭЖХ на 2-й и 3-й дни терапии меропенемом, общая длительность терапии составила 6 дней. На 2-й день терапии плазменные концентрации меропенема составляли: Cmax = 63,01 мкг/мл; Cmin = 4,28 мкг/мл. Перекрытие MIC ≤4 достигалось на протяжении 100% интервала дозирования, что гарантирует эффективность. На 3-й день терапии меропенемом также был проведен терапевтический лекарственный мониторинг, где была определена 3-я точка Сср спустя 3 ч после 1-часовой инфузии. Cmax = 70,35 мкг/мл; Сср = 14,99 мкг/мл; Cmin = 1,71 мкг/мл.

В данном случае перекрытие MIC достигалось в 77,5% от всего интервала дозирования. Никаких нежелательных реакций со стороны терапии меропенемом у пациентки не отмечено. Произошло успешное родоразрешение на 7-й день от начала антибактериальной терапии. Родился новорожденный со сроком гестации 35-36 нед (масса - 2900 г, рост - 46 см). Новорожденный мальчик выписан в удовлетворительном состоянии на 10-е сутки жизни.

Заключение. В целях повышения эффективности антибактериальной терапии в высоких дозах меропенема на основании полученных данных применение ТЛМ вполне обоснованно. Понимание основных физиологических изменений, влияющих на фармакокинетические и фармакодинамические параметры, которые происходят во время беременности, в сочетании с ТЛМ, могут помочь клиницистам в индивидуализации лекарственной терапии и оптимизации режима дозирования β-лактамных антибиотиков (меропенема) с учетом роста резистентности и MIC возбудителя в современных клинических условиях.

Литература

1. Kang J.S., Lee M.H. Overview of therapeutic drug monitoring. Korean J Intern Med. 2009; 24 (1): 1-10. PMID: 19270474; PMCID: PMC2687654.

2. Zeng M., Yi Q., Zeng L., Chen Z., Mi X., Song H., et al. (2019). Quality of therapeutic drug monitoring (TDM) guidelines is suboptimal: an evaluation using the AGREE II instrument. J. Clin Epidemiol. doi:10.1016/j.jclinepi.2019.10.007.

3. Wong G., Sime F.B., Lipman, J., Roberts J.A. How do we use therapeutic drug monitoring to improve outcomes from severe infections in critically ill patients? BMC Infect Dis. 2014; 14 (1). doi: 10.1186/1471-2334-14-288.

4. Anderson GD. Pregnancy-induced changes in pharmacokinetics: a mechanistic-based approach. Clin Pharmacokinet. 2005; 44 (10): 989-1008. doi:10.2165/00003088-200544100-00001.

5. Campbell S.C., Salisbury L.M., Roberts J.K., Kamyar M., Fredrickson J., Costantine M.M. (2016). Therapeutic Drug Monitoring in Pregnancy. Clinical Challenges in Therapeutic Drug Monitoring: 185-211. doi: 10.1016/b978-0-12-802025-8.00008-8.

6. Heikkila A., Erkkola R. Review of p-Lactam Antibiotics in Pregnancy. Clin Pharmacokinet. 1994; 27 (1): 49-62. doi: 10.2165/00003088-199427010-00005.



Применение 3D-опухолевых сфероидов в Drug Discovery

Кавиладзе М.Г.

Федеральное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), 119991, г. Москва, Российская Федерация

Application of 3D-tumor spheroids in Drug Discovery Mariam

G. Kaviladze

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), 119991, Moscow, Russian Federation

E-mail: mariam-kaviladze@mail.ru

Трехмерные культуры опухолевых клеток преодолевают ограничения традиционно используемых монослойных культур и воссоздают такие основные характеристики опухолей, как пространственные градиенты кислорода, факторов роста и метаболитов, а также наличие некротических, гипоксических, покоящихся и пролиферативных клеток.

Цель данного исследования - доказать преимущество 30-модели над 20-моделью для дальнейшего интегрирования in vitro модели опухолевых сфероидов в схему разработки противораковых лекарственных средств и использования первичных опухолевых клеток в скрининге лекарств для реализации персонифицированного лечения рака.

В рамках исследования получены многоклеточные сфероиды, сгенерированные из суспензии отдельных клеток имморта-лизованной клеточной линии аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 в сыворотке. Микрокапсулы с мультиклеточными опухолевыми сфероидами (МОС) инкубировали в 24-луночных планшетах с метотрексатом в течение 48 ч. В качестве контроля использовали монослойную культуру MCF-7 (105 кл. в лунке). Выжившие клетки количественно оценивали с помощью трипанового синего в камере Фукса-Розенталя.

При концентрации метотрексата 100 нМ выживаемость жизнеспособных клеток в контроле была вдвое меньше по сравнению с таковой для МОС. Кроме того, оценивали цитотоксическое действие капецитабина в зависимости от размера МОС. При концентрации метотрексата 100 нМ количество живых клеток составило 65 и 88% для сфероидов размером 150 и 300 мкм соответственно, в то время как в контроле это значение составило только 35%.

По сравнению с монослойными культурами раковые клетки в 30-сфероидных культурах демонстрируют большую устойчивость к цитотоксическим препаратам, причем цитотоксическое действие метотрексата уменьшается с увеличением размера МОС. В связи с этим опухолевые 30-модели представляют собой ценный инструмент для исследования рака в контексте с Drug Discovery.



Проведение терапевтического лекарственного мониторинга меропенема среди недоношенных новорожденных

Казанова А.М.1, Ивжиц М.А.1, 2, Зырянов С.К.1, 2

1 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов", 117198, г. Москва, Российская Федерация

2 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения "Городская клиническая больница № 24" Департамента здравоохранения г. Москвы, 127015, г. Москва, Российская Федерация

Therapeutic drug monitoring of meropenem among premature infants

А.М. Kazanova, M.A. Ivzhits, S.K. Zyryanov

E-mail: sandra0551@rambler.ru

Актуальность. Недоношенные новорожденные относятся к группе высокого риска по развитию инфекционных осложнений, для которой остается актуальным выбор эффективных и безопасных антибактериальных препаратов. В отделениях реанимации новорожденных отмечается драматический рост инфекций, вызванных штаммами возбудителей, у которых наблюдается тенденция к увеличению минимальной подавляющей концентрации (МПК) для меропенема в сторону промежуточной резистентности (от 2 до 64 мкг/мл) [1]. В то же время исследований по фармакокинетике меропенема у данной категории пациентов в России недостаточно.

Цель работы - повышение эффективности и безопасности антибактериальной терапии тяжелых инфекций меропенемом у недоношенных новорожденных путем проведения терапевтического лекарственного мониторинга.

Материал и методы. Концентрации меропенема в крови у 53 недоношенных новорожденных [с экстремально низкой массой тела при рождении (ЭНМТ) - 17, с очень низкой массой тела при рождении (ОНМТ) - 22 и низкой массой тела при рождении (НМТ) - 14] и гестационным возрастом от 23 до 36 нед определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием (ВЭЖХ). Постнатальный возраст (PNA) варьировал от 8 до 100 дней. На момент исследования к группе пациентов с ЭНМТ относились 2 пациента, с ОНМТ - 20, с НМТ - 31. Меропенем вводили внутривенно в дозировке 20 мг/кг через каждые 12 ч (PNA <30 дней) или через каждые 8 ч (PNA ≥30 дней). Длительность инфузии составила 1 (3 пациента), 2 (45 пациентов) или 3 ч (5 пациентов). В 2 случаях недоношенные с PNA >50 дней получали меропенем в дозировке 30 мг/кг через каждые 8 ч, в 2 случаях недоношенные новорожденные получали менингиальную дозу меропенема по 40 мг/кг через каждые 8 ч (PNA <30 дней; ОНМТ - 1, НМТ - 1). Основной диагноз - неонатальная пневмония или врожденная инфекция, вызванная чувствительными к меропенему штаммами микроорганизмов. Забор крови производился не раньше чем после 4-го введения до и сразу после окончания инфузии.

Результаты. Предиктором эффективности терапии карбапенемами является отношение времени (T), в течение которого концентрация препарата превышает МПК, ко времени между введениями препарата (T >МПК, %). Вероятность успешной эрадикации возбудителя повышается до 80-85% при T >МПК 40-50% и до 100% при T >МПК 60-70% [2]. Концентрация меропенема в крови у 75% исследуемых превышала МПК возбудителей с промежуточной резистентностью 2≤ МПК <8 в течение 100% от интервала дозирования (19 PNA <30 дней; 14 PNA >30 дней; 7 PNA >50 дней). У 6 недоношенных (1 PNA <30 дней; 2 PNA >30 дней; 3 PNA >50 дней) концентрация меропенема в крови превышала 8≤ МПК <16 в течение 100% от интервала дозирования. У 4 недоношенных PNA >30 дней минимальная концентрация меропенема, определяемая до начала инфузии, составила <1,0 мг/л, при этом уровень креатинина у 3 пациентов был ниже нормы. Можно предположить, что в данных случаях высокая скорость клубочковой фильтрации повлияла на снижение уровня концентрации меропенема в крови у недоношенных. Клинический и бактериальный ответ был выражен во всех вышеописанных случаях. Нежелательной реакции на фоне приема препарата (судороги, тромбоцитоз или повышенный уровень креатинина) не наблюдалось.

Заключение. Проведение терапевтического лекарственного мониторинга среди недоношенных новорожденных позволяет повысить клиническую эффективность терапии инфекций, вызванных штаммами с промежуточной резистентностью, и персонализировать назначение меропенема.

Литература

1. Pacifici G. Clinical Pharmacology of Meropenem in Neonates: Effects and Pharmacokinetics. Int J Pediatr. 2016; 4 (11): 3925-39. doi: 10.22038/ijp.2016.7850.

2. De Keukeleire S., Borrey D., Decaluwe W., Reynders M. Therapeutic Drug Monitoring of Meropenem in Neonate with Necrotizing Enterocolitis: A Challenge. Case Rep Infect Dis. 2016; 2016: 6207487. doi:10.1155/2016/6207487.



Вагинальная микробиота и предопухолевые процессы шейки матки

Козлов Н.Н., Волкова Л.В., Антишина А.А.

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта", Клинико-диагностический центр, 236016, г. Калининград, Российская Федерация

Рак шейки матки (РШМ) - одно из наиболее распространенных злокачественных новообразований во всем мире - является причиной смерти более четверти миллиона женщин ежегодно (FIGO IFuGaO, 2009). Вирус папилломы человека (ВПЧ) играет важнейшую роль в этиопатогенезе РШМ (Wallin K.L., 1999). Тем не менее не все случаи заражения ВПЧ высокого канцерогенного риска приводят к прогрессии и развитию цервикальной интраэпителиальной неоплазии/карциномы шейки матки, во многих случаях ВПЧ элиминируется в течение 1 года. Вероятно, это может быть обусловлено индивидуальными различиями в иммунологической защите (Huh W.K., 2009), а также наличием фоновых состояний - дисбиоза влагалища, бактериального вагиноза (БВ), который может приводить к акушерско-гинекологическим осложнениям у женщин репродуктивного возраста (Morris et al., 2001).

Цель исследования - изучение возможной ассоциации состояния вагинальной микробиоты с предопухолевыми процессами шейки матки.

Материал и методы. Проведено ретроспективное исследование данных лабораторной информационной системы за 2019 г. в Калининградской области, отобрано 66 пациенток репродуктивного возраста с гинекологической патологией, выявленной на осмотре у специалиста и прошедших комплексное лабораторное обследование с помощью морфологических (цитология, в отдельных случаях - гистология) и молекулярно-генетических методов (ПЦР-диагностика "ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов", "Фемофлор").

Результаты. В 76% случаев выявлены различные инфекции: уреаплазмоз, микоплазмоз, кандидоз, хламидиоз, цитоме-галовирусная и герпетическая инфекции, среди них гарднереллез был выявлен в 64% случаях. У 6% женщин гарднереллез сочетался с воспалением, а в 4 (6%) случаях на фоне гарднереллеза диагностирована ВПЧ инфекция. При этом у 3 пациенток выявлены по 1 типу ВПЧ (16, 51, 56), а у одной женщины имела место позитивная реакция на 4 типа ВПЧ (33, 39, 45, 58). Во всех 4 (6%) случаях ВПЧ, помимо гарднереллеза, сочетался с другими инфекциями - уреаплазмозом, кандидозом, хламидиозом, причем у 3 пациенток диагностировали LSIL (2) и HSIL (1), тогда как у четвертой женщины при цитологическом исследовании атипия не обнаружена. У одной пациентки c LSIL ВПЧ и другие инфекции не выявлены.

Среди ВПЧ-негативных пациенток в 47% случаев диагностированы микст-инфекции, в 23% случаев - одна инфекция, а еще у 21% женщин имел место нормоценоз, атипия в цитограмме не выявлена. У 2 (3%) пациенток с воспалительным процессом шейки матки инфекционные факторы не выявлены.

Заключение. Нарушение нормального микробиома влагалища при наличии ВПЧ-инфекции, вероятно, способствует развитию интраэпителиальной неоплазии. Связь вагинальной микробиоты и предопухолевых процессов шейки матки до сих пор остается нерешенной проблемой. Тем не менее при выявлении у женщин этиопатогенетических факторов канцерогенеза шейки матки, а именно ВПЧ-инфекции в ассоциации с дисбиотическими процессами, целесообразно тщательное обследование, направленное на выявление предопухолевых и неопластических процессов.



Дифференциальная диагностика преэклампсии с помощью анализа пептидомного профиля мочи с использованием масс-спектрометрии высокого разрешения

Кононихин А.С., Стародубцева Н.Л., Сергеева В.А., Муминова К.Т., Бугрова А.Е., Захарова Н.В., Низяева Н.В., Ходжаева З.С., Франкевич В.Е.

Преэклампсия (ПЭ) - одно из самых опасных осложнений при беременности, проявляющееся повышением артериального давления, протеинурией, появлением отеков конечностей. Необходимость получения надежных тестовых систем для ранней диагностики ПЭ и ее дифференцировки от патологий со сходными клиническими проявлениями (хроническая или гестационная артериальная гипертензия и др.) была отмечена Всемирной организацией здравоохранения, запустившей для этого в 2004 г. специальную программу. В ходе данного исследования разработан подход для дифференциальной диагностики ПЭ по пептидомному профилю мочи методом масс-спектрометрии высокого разрешения. По результатам работы создана уникальная база данных, включающая свыше 2000 эндогенных пептидов, обнаруженных в моче беременных. Продемонстрировано, что созданная база данных может использоваться для высокоэффективного профилирования пептидома мочи беременных с целью дифференциальной диагностики гипертензивных заболеваний, в том числе ассоциированных с ПЭ. С использованием созданной базы данных удалось сформировать панель из 126 пептидов, которая с высокой чувствительностью и специфичностью (81,1 и 93%) позволяет говорить о наличии ранних маркеров ПЭ по результатам лабораторных анализов мочи. Примечательно, что в данную панель вошли хорошо зарекомендовавшие себя ранее пептиды серпины А1 (маркеры ПЭ), причем было показано, что белок серпина А1 (α1-антитрипсин) входит в состав агрегатов, образующихся в моче и плаценте при развитии ПЭ.



Трансляционная лабораторная диагностика как научно-практическая основа внедрения лабораторных биомаркеров в клиническую практику

Кочетов А.Г. 1-3, Лянг О.В.2-4

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии Министерства здравоохранения Российской Федерации, 121552, г. Москва, Российская Федерация

2 Автономная некоммерческая организация дополнительного профессионального образования "Институт лабораторной медицины", 125057, г. Москва, Российская Федерация

3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов", 117198, г. Москва, Российская Федерация

4 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр цереброваскулярной патологии и инсульта" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117342, г. Москва, Российская Федерация

Актуальность. Развитие клинической лабораторной диагностики происходит в русле доказательной медицины, которая требует, чтобы принимаемые клинические решения базировались на диагностических методах с доказанной информативностью. Это формирует запрос на научную обоснованность использования лабораторных исследований и применение вероятностных инструментов интерпретации, соответствующих поставленным задачам. В основе инструментов интерпретации результатов лабораторных исследований лежит понятие неопределенности - аналитической, биологической и клинической. Изменение подходов к оценке лабораторных исследований привело к появлению нового направления в медицине - трансляционной лабораторной диагностике, определяющей необходимость и ценность клинического применения биомаркеров.

Материал, методы и результаты. Изучены статьи в реферативных базах данных публикационной активности PubMed и РИНЦ на наличие доказательной базы внедрения и применения лабораторных биомаркеров. На январь 2020 г. в базе данных PubMed найдено более 15 000 публикаций, связанных с биомаркерами, из них около 2300 обзорных статей и 890 оригинальных. В российской базе данных РИНЦ количество публикаций, посвященных биомаркерам различных заболеваний, меньше и составляет около 290, из которых единицы - обзорные статьи. Это подтверждает интерес исследователей к данному направлению, с одной стороны, с другой - более глубокое изучение данных публикаций обнаруживает их разнородность и отсутствие общего алгоритма в поиске биомаркеров: 75% публикаций не представляли в результатах исследования характеристики биомаркеров.

Заключение. Включение лабораторного исследования в клинические рекомендации, выбор и назначение его пациенту должны производиться не с позиции представлений о повышении или снижении лабораторного показателя при заболевании, а на основе научно доказанных характеристик теста как лабораторного биомаркера - чувствительности, специфичности, прогностической ценности, а также связи с теми или иными клиническими событиями, исходами, рисками. Эти характеристики носят вероятностный характер и могут быть определены в рамках трансляционной лабораторной диагностики.



Влияние внеклеточных везикул на коагуляционный гемостаз

Краевая Е.Е., Безнощенко О.С., Горюнов К.В., Шевцова Ю.А., Хуторненко А.А., Макарова Н.П., Кречетова Л.В., Калинина Е.А., Долгушина Н.В., Силачев Д.Н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация

Актуальность. Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой небольшие мембранные замкнутые структуры, выделяемые во внеклеточное пространство практически всеми типами клеток. Их состав варьируется в зависимости от происхождения клеток и стимула, который вызвал их образование. Они содержат функциональные молекулы и участвуют в межклеточной коммуникации. Циркулирующие ВВ проявляют прокоагулянтную активность, они были исследованы на возможную роль в некоторых патологиях человека. Тем не менее их потенциальная роль в гемостазе только начинает активно исследоваться. Также имеются данные о наличии прокоагулянтных свойств у ВВ, выделенных из биологических жидкостей (слюны, амниотической и фолликулярной жидкости). Рассмотрены механизмы участия ВВ в коагуляционном гемостазе, патологическая и физиологическая роль, а также методы исследования ВВ и их прокоагулянтной активности.

Цель - провести исследование прокоагулянтной активности ВВ, выделенных из фолликулярной жидкости и полученных от мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК).

Методы. ВВ выделяли методом дифференциального центрифугирования. Для количественной оценки и распределения по размерам ВВ использовался метод NTA (анализ траекторий наночастиц). Прокоагулянтные эффекты ВВ на кровь человека и плазму, свободную от тромбоцитов, изучали с использованием ротационной тромбоэластометрии и тромбодинамических тестов.

Результаты. В фолликулярной жидкости обнаружены ВВ, ассоциированные с тканевым фактором (ВВ-ТФ). Часть популяции ВВ несет на поверхности мембраны фосфатидилсерин (ВВ-ФС). Такие везикулы (ВВ-ТФ и ВВ-ФС) при добавлении к образцам цельной крови или плазмы крови, очищенной от тромбоцитов, активируют процессы свертывания. Также были выявлены сильные прокоагулянтные эффекты ВВ ММСК на кровь человека и плазму, свободную от тромбоцитов, с использованием ротационной тромбоэластометрии и тромбодинамических тестов. Анализ механизмов, ответственных за прокоагу-лянтный эффект ВВ, выявил присутствие тканевого фактора и других белков, участвующих в связанных с коагуляцией путях. Кроме того, мы обнаружили, что некоторые МВВ были положительными на аннексин V, что подразумевает присутствие фосфа-тидилсерина на их поверхностях, который может запускать прокоагулянтные пути. Таким образом, выявлена прокоагулянтная активность ВВ, полученных из фолликулярной жидкости и кондиционированной среды ММСК, связанная с присутствием фос-фатидилсерина и тканевого фактора. Необходимо дальнейшее детальное изучение молекулярных механизмов коагуляции, опосредованной ВВ, для определения роли ВВ в патологических и физиологических процессах.



Содержание активированных CD4+CD25high-лимфоцитов с транскрипционными факторами FOXP3+ и RORgt+ в периферической крови женщин с идиопатическим привычным выкидышем

Кречетова Л.В., Вторушина В.В., Инвияева Е.В., Тетруашвили Н.К.

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация

Актуальность. Среди факторов, приводящих к невынашиванию беременности, иммунные нарушения являются наиболее дискутабельными. Идиопатический привычный выкидыш (ИПВ) - акушерская патология, развитие которой зачастую объясняют нарушениями взаимоотношений иммунной системы матери и плода. Подтверждает это успешное применение иммунокорригирующей терапии для его лечения, особенно иммунизации пациенток лимфоцитами партнера (иммуноцитотерапии, ИЦТ). C открытием значимости для формирования антиген-специфической толерантности естественных Т-регуляторных клеток (CD4+CD25highFOXP3+-клеток, Трег) было высказано мнение, что иммунотерапия ИПВ должна иметь целью повышение толерантности материнской иммунной системы, что обусловлено данными об увеличении числа периферических Трег во время беременности и об отсутствии такой динамики у женщин с ИПВ. Наибольший интерес вызывают взаимоотношения Трег с клетками Th17-линии, или CD4+CD25high-лимфоцитов, экспрессирующих RORgt+, у женщин с ИПВ на фоне ИЦТ.

Цель - определить содержание естественных CD4+CD25highFOXP3+ и CD4+CD25highRORgt+ в периферической крови пациенток с ИПВ, получающих ИЦТ.

Материал и методы. Группу исследования составили 33 пациентки с ИПВ, забеременевшие после предгестационной ИЦТ. У 27 пациенток беременность завершилась рождением жизнеспособного ребенка в доношенном сроке, у 6 - прервалась до 12 нед гестации. Процедуру ИЦТ проводили внутрикожно в дозе 50 млн кл/процедуру, во время предгравидарной подготовки - дважды с интервалом в 1 мес на 5-10-й день менструального цикла, а во время беременности - в 5-6 и 8-9 недгестации. Оценку в периферической крови доли FOXP3+- и RORgt+-клеток среди CD4+CD25high-Т-лимфоцитов проводили с помощью стандартного набора "FOXP3 Staining Buffer Set" (eBioscience, США). До пермеабилизации клетки окрашивали антителами к СD4 (FITC) и антителами к CD25 (РЕ) После пермеабилизации клетки были окрашены антителами к FOXP3 или RORgt, меченными АРС (eBioscience, США). Анализ проводили на проточном цитофлуориметре Gallios фирмы Beckman Coulter (США).

Результаты. Доля FOXP3+-Трег среди CD4+CD25high-клеток у женщин с доношенной беременностью была сходной в разные сроки обследования, не отличаясь от доли у женщин контрольных групп, как вне беременности, так и в 12 нед гестации. Доля RORgt+-клеток до предгестационной ИЦТ и была значимо выше, чем в контроле (р=0,0008), после предгестационной ИЦТ различия сохранились (р=0,029), но в 12 нед гестации отсутствовали. При анализе динамики доли FOXP3+ и RORgt+ у пациенток, потерявших беременность, отмечено транзиторное снижение доли FOXP3+Трег после предгестационной ИЦТ, а доля RORgt+-клеток в 5-6 нед гестации имела минимальные значения за весь период наблюдения. Таким образом, после предгестационной ИЦТ у женщин, потерявших данную беременность, был низкий уровень FOXP3+Трег, подавляющих провоспалительные Th17-зависимые реакции, без изменений в уровне активированных Th-17-клеток, а в сроке 5-6 нед уровень СD4+CD25highRORgt+-лимфоцитов был резко снижен по сравнению с уровнем вне беременности.

Заключение. Показана различная динамика содержания активированных CD4+CD25high-лимфоцитов, экспрессирующих FOXP3+ и RORgt+, как в прегравидарном периоде, так и в I триместре в периферической крови женщин с ИПВ с разными исходами беременности, наступившей после предгестационной ИЦТ.



Иммуноблоттинговый анализ С1-ингибитора пациентов в изоэлектрофоретически разделенных С4-зависимых патологических агрегаиионных областях

Лахтин М.В., Лахтин В.М., Андина С.С.

Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 125212, г. Москва, Российская Федерация

E-mail: Lakhtinv@yandex.ru

Нами предложена стратегия проведения иммуноблоттингового анализа функциональной активности (экспонированности, доступности, маскирования, латентности) компонентов комплемента, способных образовывать ковалентно сшитые агрегаты. На примерах изотипов С4А и С4В комплемента пациентов нами было показано, что диапазон pI 3,84,7 относится к патологическим агрегационным областям (ПАО) белков. Нами разработан хемилюминесцентный иммуноблоттинговый анализ (ХИБА) установления областей С4А (обогащенной преимущественно белковой составляющей) и С4В [обогащенной гликанами и гликоконъюгатами (ГК)]. Появление С1ин в ПАО свидетельствует в пользу потребления С1ин (функционального дефицита) с образованием не выводящихся из кровотока агрегатов с антигеном С1ин.

Цель - применить ХИБА функциональной активности С1инг комплемента пациентов.

Материал и методы. Исследовали сыворотки пациентов, проходивших обследование в КДЦ при Институте им. Г.Н.Габричевского. Сыворотки разделяли изоэлектрофокусированием (ИЭФ, рН 3-5) в пластине полиакриламидного геля (ПААГ). Гель электроблоттировали на мембранный сэндвич Durapore (Millipore)-Immobillon P (Millipore). Иммобиллоновый блот обрабатывали ацетатным буфером рН 4. С4А, С4В, С1инг и С3 проявляли моноспецифическими антителами (АТ), выделенными из поликлональных моноспецифических антиС4 (или антиС3, антиС1инг)-сывороток. Использовали конъюгаты кроличьих или козьих АТ (IgG) к С4, С3 или С1инг человека. Белки проявляли SYPRO protein blot stain (Bio-Rad). Пероксидазу активировали хемилюминесцентным субстратом BioWest (Pierce, США). Флюоресценцию красителя (возбуждение при 254 нм) и хемилюминесценцию пероксидазы наблюдали в системе BioChemi System (UVP). Регистрировали ступенчатую кинетику дифференцированной интенсивности хемилюминесценции. Анализ картин - с использованием программ LabWork-4.

Основные результаты. 1. С1инг локализовался в зоне гликаны/ГК-содержащих и связывающих белковых комплексов сыворотки, характерной для расположения С4В. 2.Связывание АТ к С1инг не зависело от связывания АТ к С4 (в сыворотках с дефицитом изотипа С4В комплексы АТ к С1инг обнаруживались в области отсутствия изотипа как в случаях наследственного дефицита С4В) или С3 (влияющего на область между С4А и С4В, в отличие от С1инг). Наблюдались различающиеся по локализации мишени в С4В-области для АТ к С4 или С1-инг. Содержание С1инг было выше в сыворотках с дефицитом С4В при сравнении с сыворотками с дефицитом С4А. ХИБА дефицита С1инг отчетливо проявлялся в случае сывороток с наследственным дефицитом С4В. В некоторых сыворотках пациентов с аутоиммунными болезнями определение С1инг не зависело от предварительного десиалирования сывороток, что указывало на глубину системного поражения организма.

Выводы. 1. ХИБА С1инг важен для дальнейшей дифференциации различий сывороток с установленными дефицитами С4А и С4В, как в случаях системной красной волчанки и антифосфолипидного синдрома. 2. С1инг преимущественно сцеплен с ПАО С4В в связи с кофункционированием С1инг в С4-каскаде. 3. Выявлена перспективность ПАО, установленных для С4А и С4В, для оценки дефицита С1ин.



Иммуноблоттинговый хемилюминесцентный анализ разделенных агрегатных антигенов микроорганизмов в крови в связи с функционирующей системой комплемента

Лахтин М.В., Лахтин В.М., Афанасьев С.С., Алешкин В.А.

Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 125212, г. Москва, Российская Федерация

E-mail: lakhtinv@yandex.ru

Цель - предложить экспериментальный подход, предусматривающий применение функциональных ELISA и ХИБА разделенных агрегатных антигенов в крови.

Материал и методы. В качестве антигенов использовали дифтерийный анатоксин АДС-М (ГИСК им. Л.А. Тарасевича) и Кодивак - пептидополисахарид клеточной стенки симбионтных коринебактерий C. d. (tox-) (МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского). Сыворотки - от пациентов, проходивщих обследование при КДЦ им. Г.Н. Габричевского. Кроличьи или козьи антитела (АТ) к дифтерийным антигенам, компонентам С4, С3 и С1-ингибитору, конъюгаты АТ к С4, С3 с пероксидазой -в рабочих разведениях. Использовали разработанные нами ELISA определения сывороточного изотипа С4А или С4В в реакции ингибирования ковалентного связывания активированного C4b с IgG или ЛПС S.typhimurium; ХИБА С4А или С4В, предполагающий предварительное десиалирование сывороток экзо-альфа-сиалидазой (КФ 3.2.1.18) C. perfringens согласно разработанному нами методу, разделение изотипов изоэлектрофокусированием в пластине 5% полиакриламидного геля в присутствии 7 М мочевины и 5% сахарозы в градиенте рН 3-5, электроблоттинг на мембранный сэндвич Durapore (Millipore)-Immobillon P (Millipore), обработку иммобиллонового блота конъюгатом АТ с пероксидазой. Хемилюминесценцию пероксидазы в присутствии субстрата BioWest (Pierce, США) регистрировали в BioChemi System (UVP, США) в живом изображении. Анализ картин -с помощью программ Labwork-4.

Результаты. 1. Установлена различная эффективность дифтерийных антигенов в ингибировании образования C3-конвертазы (КФ 3.4.21.43). Пептидополисахарид предпочтительнее ингибировал образование конвертазы из C4B изотипа, а белковый - из C4A. По данным ELISA и иммуноблоттингового хемилюминесцентного анализа разделенных агрегатных антигенов микроорганизмов в крови в связи с функционирующей системой комплемента (ФИХА), дефициты C4A соответствовали ухудшению антитоксического ответа, а дефициты C4B -ухудшению антибактериального ответа. 2. Гликозилированный антиген С1ин (35% углеводов) локализовался преимущественно в области С4В, содержал легко удаляемые сиаловые кислоты, мог быть индикаторов глубины поражения организма аутоиммунными болезнями. 3. По данным ФИХА, иммунный ответ на антигены возможно регистрировать по наличию Ig в агрегатах: IgG (преимущественно область С4А), IgA (преимущественно область С4В), IgM (область частично перекрывалась со стороны анода с областью С4А).

Выводы. 1. Предложенный подход перспективен для оценки статуса экспонированности агрегатных антигенов микрорга-низмов в кровотоке пациентов, а также в связи с исследованием ингредиентов вакцин. 2. Результаты указывают на потенциал ФИХА для функциональноой оценки синтетических ГК, кофункционирующих с компонентами комплемента. 3. Отсутствие экспонированных сиаловых кислот в агрегатных гликоантигенах (С4 или С1ин) до обработки сиалидазой - признак глубокого поражения организма, индикатор вероятного присутствия в крови сиалидаз инфекционной природы. 4. Возможен мониторинг антительного ответа по имиджевому перераспределению классов Ig в агрегатах. 5. ФИХА может быть полезен в оценке динамики аутоиммунной болезни и иммунодефицитного статуса пациента.



Система изотипа С4А-компонента С4-комплемента: маркер глубокого поражения аутоиммунными болезнями

Лахтин М.В., Лахтин В.М., Миронов А.Ю., Алешкин В.А.

Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 125212, г. Москва, Российская Федерация

E-mail: lakhtinv@yandex.ru

Дефициты изотипов С4А и С4В комплемента крови отражают риск болезней. Нами разработаны варианты твердофазного ИФА дефицита изотипа в микропанели и на блоте. Преимущества хемилюминесцентного иммуноблотингового анализа (ХИБА) в сравнении с ELISA - сенсорность, наборы субизотипов, регистрация в реальном времени.

Цель - биомаркерная значимость субизотипов С4 пациентов с аутоиммунными болезнями (АИБ).

Материал и методы. Исследовали сыворотки пациентов, проходивших обследование в КДЦ при МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Сыворотки десиалировали разработанным нами методом использования нейраминидазы (КФ 3.2.1.18) Clostridium perfringens в условиях инактивации комплемента, разделяли в полиакриламидном геле (ИЭФ-ПААГ, рН 3-5, рН 2-6). Гель электроблоттировали на мембраны Durapore-ImmobillonP (Millipore). Блотт-рН7 обрабатывали ацетатом рН 4 или электро-блоттировали с образованием блотта-рН 4-ацетат. Субизотипы изотипов С4А и С4В проявляли поликлональными очищенными антителами (АТ) к С4 человека, конъюгированными с пероксидазой. Для выявления в агрегатных комплексах других белков использовали пероксидазные конъюгаты АТ к IgG, IgA, IgM, С3 или Clq человека. Пероксидазу проявляли субстратом BioWest (Pierce, США). Белки проявляли SYPRO protein blot stain (Bio-Rad). Регистрировали ступенчатую кинетику дифференцированной интенсивности хемилюминесценции в системе BioChemi System (UVP) в ряду экспозиций.

Основные результаты. 1. В сыворотках пациентов в белковых агрегатах с pI 3,8-4,7 (области I) регистрировались антигены С4 изотипов и их субизотипов, что отражало процессы потребления С4 крови из области pI 5-6 (области II). В результате перехода изотипов в состав сборочных белковых агрегатов, первично присутствующих в сыворотках пациентов, в I регистрировалось накопление агрегатных продуктов, обусловленных АИБ. Присутствие белковых агрегатных комплексов с ассоциированными антигенами С4 подтверждено АТ к Ig-классам и другим компонентам комплемента. Кроме того, агрегаты с pI 4,0-4,1 бычьего сывороточного альбумина появлялись в I из II. Степень агрегированности С4А (pI 4-4,4) превосходила таковую С4В (pI 4,5-4,7). 2. В случаях системной красной волчанки (СКВ) и антифосфолипидного синдрома (АФС) в I накапливались белковые агрегаты с антигенами С4 в зоне С4А на фоне дефицита таковых в зоне С4В, что указывало на наследственный недостаток С4В. рН 4-обработка блотта ацетатом усиливала дискретность субизотипов. 3. Среди сывороток с дефицитом изотипа ХИБА выявлял раннюю форму - А5-блот-рН7/pH4 pI 3,8 у пациента с СКВ, сочетанной с АФС. Предположили, что форма pI 3,8 вовлекает участие в агрегатах IgM-ревматоидного фактора.

Выводы. 1. Выявлена форма А5-блот-рН7/рН4 pI 3,8 - имиджевый биомаркер глубины поражения АИБ в случае СКВ, переходящей в катастрофический АФС. 2. Результаты указывают на перспективы С4А-прогностики наследственных рисков АИБ. Открыта перспектива создания С4-зависимого банка сывороток пациентов с АИБ. 3. ХИБА будет полезен и при оценке состояния пулов плазмы для переливания крови.